一、胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化（论文文献综述）
刘云[1]（2021）在《hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析》文中研究表明目的:1.用pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析慢病毒对三种不同来源人间充质干细胞的转导效率。2.将成功标记绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续传代培养,分析传代培养对绿色荧光蛋白基因阳性的细胞形态及荧光表达的影响。3.测定荧光蛋白标记前后的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖、分化及细胞表型,分析慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对人间充质干细胞增殖、分化及细胞表型的影响,为后续干细胞体内示踪奠定基础。方法:1.用相同MOI值pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测三种不同来源人间充质干细胞的慢病毒转导效率。2.将标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养传代,观察细胞形态的变化和绿色荧光蛋白基因的表达,流式细胞仪检测细胞增殖10代后绿色荧光蛋白阳性细胞的比例。3.对绿色荧光蛋白标记前后的细胞用CCK-8法测定细胞增殖情况,用定向诱导分化培养液进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色液分别对分化后的细胞染色,流式细胞仪测定标记前后细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR的表达。结果:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率存在明显差异,且差异具有显着统计学意义（P<0.01）。结果显示,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞慢病毒转导效率最高,其次是人脐带间充质干细胞,人脂肪间充质干细胞转导效率最低。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代,倒置荧光显微镜下仍然可见几乎所有细胞均带有绿色荧光。自然光线下可见细胞贴壁成梭形,胞质丰富,细胞整体成漩涡状生长,均保持了正常良好的细胞形态,与同代数未转导干细胞比较无明显差异。3.标记有绿色荧光蛋白的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖曲线和未标记细胞相近,在450nm波长下测得的OD值无统计学差异（P>0.05）,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞标记绿色荧光蛋白基因后依然能分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,流式细胞仪测定表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95%以上,CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达（<0.2%）。与同代数未转导干细胞表面抗原表达结果一致。结论:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率有显着差异（P<0.01）,分析可能与间充质干细胞来源的不同或细胞增殖力差异等有关。2.标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代后细胞形态正常,且绿色荧光蛋白的表达未衰减,提示绿色荧光蛋白基因可在细胞内长期稳定表达,适用于干细胞的长期标记。3.慢病毒GFP基因转导对人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的生长增殖、分化及细胞表型无不良影响,表明慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对细胞无毒害,且可在细胞内稳定表达,是一种理想的干细胞标记方法。
袁霞[2]（2021）在《CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究》文中指出在哺乳动物中,可以通过体细胞核移植、体外受精和胚胎移植等胚胎工程技术以及超低温冷冻技术实现种质资源的保护和物种复原。然而由于禽类为卵生动物,其胚胎发育方式与哺乳动物相比有很大差异,导致这些胚胎工程技术和冷冻保存技术无法在禽类上广泛应用,极大地阻碍了禽类胚胎工程的研究和珍稀物种保护工作。而禽类原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）具有迁移的特性,体外培养的鸡PGCs注入正常孵化的鸡胚血管后可在受体胚胎性腺中增殖并产生了嵌合体鸡,且鸡PGCs移植到鸭早期胚胎中也能够获得嵌合体鸭,表明PGCs的异体/种间移植或许能解决禽类种质资源保存的问题。然而由于分离原代PGCs细胞数量少,且需以牺牲早期胚胎为代价,导致PGCs异种间移植应用并不广泛,禽类种质资源保护仍面临巨大难题。2006年,诱导干细胞技术问世,体细胞经过诱导重编程能够形成与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）类似的诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS）,诱导体细胞重编程技术的出现给为珍稀禽类的保种、转基因禽类的生产等研究开辟了新思路,诱导体细胞重编程技术能够为禽类的胚胎工程和转基因工程研究提供新的干细胞来源,诱导重编程所需的禽类体细胞的分离和冷冻技术相对简单,能够短时间获取大量的细胞,并且对个体不会造成较大伤害,因此,若能通过诱导重编程技术将禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs,便能极大地解决PGCs分离困难且无法大量获得的难题。目前,诱导体细胞重编程技术已在小鼠、人、大鼠、猪、猴、牛、羊、鸡等多个物种上成功应用。本课题组前期建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代,同时建立了 CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为iPGCs的转分化体系,但这一转分化体系的诱导效率较低,且CEF转分化形成的iPGCs细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚。因此,本研究利用OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）因子体系诱导黑羽狼山鸡CEF重编程为iPS,对该体系进行优化,通过BMP4/BMP8b/EGF体系将其诱导分化为iPGCs,进一步通过转录组测序对不同体系诱导获得的iPS细胞及iPGCs进行分析,分别比较其与原代ESCs和PGCs之间的异同,最后通过鸡胚血管移植的技术将黑羽狼山鸡iPGCs移植到受体隐性白羽鸡中,孵化出壳后饲养至性成熟,通过公母鸡自交产生后代,借助微卫星检测以及基因组重测序分析后代鸡是否来源于黑羽狼山鸡iPGCs,为实现PGCs在禽类种质资源保护过程中的广泛应用奠定基础。研究结果如下:（1）鸡iPS诱导体系的优化本研究利用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A（OSNL）重编程体系对鸡成纤维细胞CEF进行诱导重编程,获得了与ESCs有相似特性的狼山鸡iPS,为碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外能够分化形成类胚体且表达三胚层标记基因。荧光定量结果显示,从诱导重编程的第6天开始,内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等的表达逐渐被激活,而成纤维细胞标记基因Thy-1的表达逐渐被沉默。对重编程过程中不同天数的糖酵解相关基因表达、酶活性、葡萄糖摄取量及乳酸产生量的变化进行检测,结果显示,从诱导的第6天开始,重编程过程中糖酵解相关基因Hk1,Ldha,Glut1,Pfkp表达逐渐上调,并且糖酵解关键限速酶己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）及果糖-6-磷酸激酶（PFK）活性在诱导第9天均显着增强（P<0.05）。同时,葡萄糖摄取量逐渐增加,乳酸产生量出现极显着堆积（P<0.01）,表明鸡CEF诱导重编程为iPS的过程中糖酵解被激活。此外,随着重编程的进行,氧化磷酸化相关基因Ndufa10及Cox4i1的表达极显着下调（P<0.01）,且鸡iPS细胞的线粒体膜电位与CEF相比出现明显下降,表明氧化磷酸化被抑制。进一步通过添加糖酵解抑制剂和激活剂发现糖酵解能够激活内源多能性基因表达从而促进鸡iPS形成。通过生物信息学分析发现Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha的启动子区有共同的结合位点,双荧光素酶报告实验检测显示过表达Oct4,Sox2,Nanog极显着上调了Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性（P<0.01）,且过表达Oct4,Sox2,Nanog能够上调Hk1、Pfkp和Ldha的表达并提高糖酵解水平。因此本研究OSNL体系的基础上筛选了糖酵解激活剂2i-SP来优化iPS诱导体系,结果显示,添加2i-SP后糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Glut1的mRNA表达均上调,葡萄糖摄取量和乳酸产生量也有不同程度的提高。同时添加2i-SP后,诱导产生的iPS克隆数从24.33±2.08极显着增加至47.00±3.61（P<0.01）,流式分析检测SSEA-1阳性细胞比例也从1.59%±0.08极显着升高到11.47%±1.93（P<0.01）,表明2i-SP通过激活糖酵解来促进鸡iPS形成。以上结果表明糖酵解能够协同核心多能性因子促进鸡体细胞诱导重编程,小分子化合物2i-SP能够提高鸡iPS的形成效率。（2）不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究为了比较分析体外诱导重编程形成的鸡iPS细胞与ESCs的转录水平的异同以及添加不同小分子化合物对鸡iPS形成的影响,分析干细胞形成和糖代谢相关因子在不同诱导条件下的表达变化,本研究对不同体系诱导的鸡iPS、CEF及鸡ESCs进行RNA-seq,首先对不同样本的log10（FPKM）进行聚类热图分析,结果显示,重编程后的iPS基因表达模式与ESCs相似。对糖酵解及氧化磷酸化相关基因FPKM值进行聚类热图分析,结果显示iPS（OSNL）中糖酵解相关基因Hk1、Ldha、Pdk3、Pdk4、Pfkp、Slc2al、Hif1a等基因表达水平均高于iPS（OSNL）,而氧化磷酸化相关基因Mdufs1-6,Ndufa1-12等的表达水平均低于CEF,表明CEF诱导重编程为iPS后其代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解。在iPS（OSNL）组和CEF组中,存在8376个基因差异表达,所有差异表达基因主要富集到细胞代谢相关的条目以及许多与糖代谢、脂代谢、蛋白合成相关的通路。与iPS（OSNL）vs CEF组相比,iPS（OSNL2i-SP）vs CEF组中有1 751个特异上调表达基因,主要富集到细胞生长调节、细胞周期正调控、胚胎骨骼系统形态发生等细胞生长发育调控的相关条目,并且还富集到自噬体、糖:质子转运体活动及碳水化合物代谢过程。（3）鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究本研究通过BMP4/BMP8b/EGF将黑羽狼山鸡iPS诱导分化,获得了 PAS染色阳性且表达Cvh、c-KIT、Blimp1等PGCs标记基因的iPGCs。对鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化进行检测发现在iPS诱导分化为iPGCs的过程中,糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Ldha的表达逐渐下降,并伴随着氧化磷酸化相关基因Ndufa10和Cox4i1表达的逐渐增加,同时葡萄糖摄取量逐渐减少,乳酸产生量也逐渐降低,表明鸡iPS诱导分化为iPGCs的过程中糖酵解被抑制。为了全面解析iPGCs中基因的表达情况;鉴定iPS来源的iPGCs是否具有正常的PGC相似的特性,以及研究iPGCs体外诱导形成过程中的机制,本研究对iPS诱导的iPGCs进行了转录组测序。层次聚类结果显示iPS来源的iPGCs的表达模式接近于原代PGCs。根据筛选出的PGCs标记基因表达情况制作小提琴图,结果显示iPS体外诱导的iPGCs细胞的PGCs标记基因表达模式与原代PGCs相近。在鸡iPGCs（iPS derived）组与PGCs组中,6555个基因存在差异表达,所有差异表达基因主要富集到了一些与糖类、脂类及蛋白质代谢相关的条目以及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸代谢、自噬和PPAR等信号通路,表明这些信号通路在体外诱导iPGCs的过程中可能发挥了重要的调控作用。（4）鸡iPGCs介导类克隆体系的建立本研究将黑羽狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs注射至孵化2.5天的隐形白羽鸡F1的血管中,建立鸡iPGCs介导的类克隆体系,利用F1代公母鸡自交获得了类克隆鸡后代F2,并对F2代类克隆鸡进行了微卫星鉴定。狼山鸡iPGCs经PKH26红色荧光细胞膜表面标记后在显微镜下呈红色荧光,分离移植了 PKH26标记的黑羽狼山鸡iPGCs细胞后的白羽鸡种蛋的生殖嵴,在显微镜下观察到受体鸡胚生殖嵴中PKH26标记的红色荧光。移植了黑羽狼山鸡CEF诱导重编程获得的iPGCs的F1代受体隐性白羽鸡胚共100枚,继续孵化至出壳并存活的F1代受体隐性白羽鸡共45只,饲养至性成熟后进行公母鸡自交,收集所产受精蛋孵化至出壳,记为F2代,共获得517只F2代后代鸡,其中F2代阳性类克隆鸡个数为193只类克隆鸡阳性率为37.33%。F2代继续饲养,至性成熟时进行测交,收集受精种蛋孵化至出壳,鸡为F3代,共获得140只F3代后代鸡,其中阳性类克隆鸡个数为64只,类克隆鸡阳性率为45.71%,接近50%。本研究选择MCW004及MCW104微卫星位点作为黑羽狼山鸡的特异分子标记,对F2代阳性类克隆鸡进行了 MCW004及MCW104位点的微卫星测序检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点的长度均不一,但阳性后代中仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明类克隆鸡为狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs来源的后代。本研究对F2代类克隆鸡自交产生的F3代类克隆鸡同样进行了微卫星检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点长度仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明本研究的CEF转分化为iPGCs介导的类克隆技术能够稳定遗传原供体的遗传特性。
张云峰[3]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中进行了进一步梳理绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
袁伟燕[4]（2021）在《KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制》文中指出背景:生殖细胞是向下一代传递遗传和表观遗传信息的重要环节,生殖细胞的缺陷可导致不孕不育等疾病的发生。人类原始生殖细胞（human primordial germ cell,hPGC）特化是人类生殖和进化的基础,这一过程发生在囊胚着床后不久（约在孕2～3周）,该时期胚胎组织获取困难,不利于体外研究的开展,hPGC的特化机制目前尚无报道。尽管人类原始生殖细胞样细胞（human primordial germ cell-like cell,hPGCLC）的体外诱导系统已经建立,可以相应呈现hPGC早期发育特征,然而hPGCLC的特化机制目前仍不清晰。目的:了解人类生殖细胞的发育和调控机制,对生殖生物学和临床相关疾病的研究具有理论指导意义。本研究拟通过探讨表观遗传因子与转录谱在人类原始生殖细胞样细胞的特化过程中的相关性,以揭示其分子调控机制,为理解体内原始生殖细胞发育及特化机制提供参考。方法:我们首先利用体外诱导体系从hES细胞系中诱导获得人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）,借助RNA-seq技术检测了 KDM2B在不同时间点hPGCLC中的动态表达。为了进一步探究KDM2B缺失对hESC自我更新或多能性的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑工具建立KDM2B敲除（Knock out,KO）的hES细胞系;通过QPCR及蛋白印迹检测KDM2B的敲除效果,核型分析实验检测KDM2B KO hES细胞系的核型。利用QPCR、免疫荧光、小鼠皮下畸胎瘤实验等,对敲除细胞系中干性基因的表达及向三胚层分化的能力等进行检测。另外,将体外培养的KDM2B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式细胞分选术分选不同时间点的拟胚体中的hPGCLCs,同时利用免疫荧光验证hPGCLC的分化效率。进一步通过转录组学分析寻找KDM2B KO hPGCLCs的特异性基因表达谱,为揭示hPGCLC基因表达的分子机制提供参考。其次,利用CRISPR/Cas9技术建立KDM5B KO hES细胞系,QPCR检测其多能性基因的表达。将体外培养的KDM5B KO hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率。最后,利用四环素基因调控（TetOn）系统在KDM2B KO hESCs中建立Dox诱导外源性KDM2B稳定表达的hESC系。将重新表达KDM2B的hESCs向hPGCLCs诱导分化,利用流式分选hPGCLCs,并用免疫荧光进一步验证分化效率,通过回补实验验证KDM2B在hPGCLC特化中的作用。结果:我们发现,KDM2B在人类胎儿生殖细胞及体外诱导分化的hPGCLC中高表达,提示KDM2B可能在hPGCLC分化中发挥了作用。KDM2B KO hESCs与WT hESCs一样呈现紧密的圆形克隆形态,且均表达经典的多能性基因;并且,KDM2B KO hESCs与WT hESCs组一样也能形成具有三个胚层的畸胎瘤。表明KDM2B的缺失对hESC的干性维持和向三胚层分化的能力没有明显影响。将KDM2B KO hESCs与WT hESCs在4种激酶抑制剂（4i）中培养4天,并向hPGCLC诱导分化6天,发现KDM2B KO组中hPGCLC的分化效率在向hPGCLC诱导的第二天开始显着降低,KDM2B的耗竭显着损害了原始生殖细胞样细胞的分化,表明KDM2B在hESC向hPGCLC的特化过程中发挥了重要作用。转录组数据显示,在hPGCLC特化过程中,与hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的生殖细胞基因不同,KDM2B敲除的hESCs向hPGCLCs诱导一天的细胞中高富集的为心脏形态发生的中胚层基因,且内胚层基因GATA5也出现上调,提示缺失KDM2B细胞在诱导为hPGCLCs第一天时已经发生体细胞分化。因此,我们推测KDM2B在hPGCLC特化的过程中可能发挥了抑制体细胞基因表达进而抑制其向体细胞方向转变的作用。值得注意的是,一些表观遗传调控因子如KDM5B、TET1在WT Day 2hPGCLCs中显着上调,而在KDM2B KO Day 2hPGCLCs中这些基因并没有转录激活,说明KDM2B的缺失影响了hPGCLC特化过程中的表观遗传学特征,而DNA甲基化失调可导致靶基因的转录异常,KDM2B的缺失导致一些表观遗传因子的改变,可能影响了 hPGCLC发育过程中细胞命运的决定。我们的数据显示,敲除KDM2B的hESC中H3K4me3的另一个去甲基化酶KDM5B的表达上调,提示可能是KDM2B缺失后的补偿效应。然而我们构建了KDM5B KO hES细胞系并将其向hPGCLCs方向分化,发现缺失KDM5B组hPGCLCs的分化效率与WT组无明显差异,说明KDM5B对于hPGCLC的特化并非不可或缺。最后,我们利用Tet-On诱导基因表达系统在KDM2B KO hESCs中建立受四环素（Doxycycline,Dox）调控稳定表达KDM2B的hES细胞系,将KDM2B的表达激活到内源性水平,发现加Dox表达KDM2B组的拟胚体中hPGCLCs的分化效率明显增高。结果说明通过外源性表达KDM2B可以修复由于缺失KDM2B引起的hPGCLC分化受损,进一步验证了 KDM2B的表达是hPGCLC特化的重要因素之一。结论:本研究发现虽然缺失KDM2B对人胚胎干细胞的干性维持和三胚层分化的潜能没有明显影响,但KDM2B的耗竭显着损害了 hPGCLCs的特化,而外源性表达KDM2B能有效地挽救这种损害,表明缺失KDM2B损害了生殖细胞特化。转录组结果表明,在hPGCLC特化过程中,KDM2B通过抑制体细胞基因的表达,进而抑制其向体细胞方向转变的作用。本研究表明,KDM2B是hPGCLC特化不可缺少的表观遗传调控因子,为研究表观遗传调控如何协调hPGC发育中的转录事件提供了一个新的角度。
肖倩茹[5]（2020）在《基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究》文中研究表明目前,心血管疾病仍然是威胁人类健康的头号杀手。心血管疾病的传统药物开发和研究主要依赖于动物模型,但由于种间差异,动物模型并不能很好地模拟人体心脏的真实环境,因此,即便这些药物顺利地通过了动物实验,也有较大可能在临床上表现出很强的毒副作用,最终不得不被撤回。因此,针对心血管疾病的药物开发仍然面临着巨大的挑战。近年来,科研人员们致力于利用人源细胞构建体外心脏模型的研究。体外心脏模型可以更真实地模拟人体心脏的生理和功能环境,有效提高临床前药物评估的安全性和可靠性。本论文主要研究了人源心肌细胞的来源,并利用人头发丝作为支架材料构建体外心肌组织,研究了体外心肌组织的收缩性能。由于成人心肌细胞是终末分化细胞,缺乏增殖和再生的能力,因此,体外人源心肌细胞的获取主要依赖于干细胞分化。人多能干细胞,包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞,具有很强的增殖能力以及在特定条件下向不同细胞系分化的潜能。本文主要通过小分子诱导法和商用试剂盒法两种方法来诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化。小分子诱导法首先通过糖原合成激酶3抑制剂CHIR99021分子来激活Wnt信号通路,然后再利用IWR-1分子来抑制Wnt信号通路,从而诱导人诱导多能干细胞分化为心肌细胞。而商用试剂盒法则是通过在不同的培养时间点添加不同的试剂,来获得心肌细胞。通过比较两种方法我们可以发现,小分子诱导法成本较低,可以获得单层收缩的心肌细胞,而商用试剂盒法虽然成本较高,但其心肌分化效率也更高。两种分化方法在我们后续的体外心肌组织构建和研究实验中均有涉及。在确定心肌细胞的来源以后,我们采用了人头发丝作为支架材料来构建体外心肌组织。首先,我们构建了以短直头发丝作为悬挂模板的体外心肌组织（心肌条）并对其进行了长期培养。结果表明,头发丝作为悬挂模板有助于悬挂心肌条的形成,心肌条可以很好地在头发丝之间收缩,并且该支架可以支持心肌条的长期培养（最长培养时间达118天）。随后,我们又将人头发丝制备成弹簧结构,并将头发丝弹簧与短直头发丝一起组合作为支架,来构建心肌组织,并研究了头发丝弹簧与短直头发丝的不同组合方式对心肌组织的收缩性能的影响。结果表明,头发丝弹簧的引入可以使得体外工程化心肌组织的收缩更具有立体感,并且明显提升工程化心肌组织的收缩性能。最后,为了更定量地了解体外心肌组织的收缩力,我们制备了一系列不同直径和不同长度的头发丝弹簧,并测量了弹簧的弹性系数,我们发现头发丝弹簧的弹性系数可以低至0.019 N/m,与原子力显微镜用于测量细胞的探针的弹性系数相当,足以测量心肌组织的收缩力。于是,我们用头发丝弹簧和两根短直头发丝组建了一个测量心肌组织收缩力的装置。该装置可以在体外心肌组织的培养过程中,实时地通过视频观察,测算出心肌组织的收缩力。
杨桃[6]（2020）在《人胆囊上皮干性细胞体外诱导为胰腺β样细胞的研究》文中指出糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,其发病率逐年上升,日益成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。以胰岛移植为代表的β细胞替代治疗在糖尿病治疗方面显示出了巨大的应用前景,但是供体的缺乏限制了其在临床上的大规模运用。获得足够数量的细胞是使其走向临床大规模运用的重要前提,而以多能干细胞分化为胰岛β样细胞的技术路径又存在致瘤的安全风险。寻找其他合适的干/前体细胞可能是解决这些问题的较好选择。研究显示,胆囊上皮存在具有胰腺前体细胞特性的干性细胞,而且这些干性细胞具有向胰岛β细胞方向分化的可能性。然而,现有的细胞分离和培养方法所能获得的干性细胞在数量上都是非常少的,这在很大程度上限制了该领域的研究进展,而且也在很大程度上“朦胧”了以胆囊上皮干性细胞制备胰岛β样细胞的科学设想在转化医学中的潜在意义。为了突破基于胆囊上皮干性细胞向胰岛β样细胞诱导分化体系中的“诱导起始细胞数量有限”这一瓶颈因素,本课题旨在深入认识胆囊与胰腺相互联系的基础上,寻找新的“诱导起始细胞”,并在此基础上发展新的、更为理想的诱导体系,为糖尿病的β细胞替代治疗提供新的思路。为了实现这一目标,本课题从以下几个方面开展了研究:1)探索胆囊与胰腺相互联系:分析以胰十二指肠同源盒1（pancreas duodenal homebox-1,PDX1）、性别决定区框17（sex determining region Y-Box 17,SOX17）、性别决定区框9（sex determining region Y-Box 9,SOX9）和叉头盒蛋白A2（forkhead box protein A2,FOXA2）为代表的胰腺前体细胞特征,以及分别以胰岛素和胰腺淀粉酶为代表的胰腺内、外分泌特征在人原位胆囊上皮的表达情况;2)探索三维培养对于扩增胆囊上皮干性细胞的能力:在无菌条件下,刮取人正常胆囊上皮细胞,包埋入基质胶（matrigel）组成的三维环境中,添加表皮生长因子（epidermal growth factor）、成纤维细胞生成因子10（fibroblast growth factor 10）以及R-脊椎蛋白1（roof plate-specific spondin 1）等生长因子进行培养,评价三维培养扩增胆囊上皮干性细胞的能力;3)探索三维培养胆囊上皮细胞获得的球形克隆的细胞来源:对球形克隆以上皮标志物上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM）和细胞角蛋白19（cytokeratin 19）,极性标志物黏蛋白-1（mucin-1）和层黏连蛋白α1（lamininα1）等进行免疫荧光染色和流式分析鉴定,确定球形克隆的细胞起源;4)探索球形克隆细胞干性特征:以包括PDX1、SOX17、FOXA2和SOX9在内的多种胰腺前体细胞标志对球形克隆进行鉴定,了解球形克隆细胞干性表达和分布情况;5)探索球形克隆细胞向胰岛β细胞方向分化的化学诱导方法:基于已有关于胰岛β细胞“胰腺前体细胞—胰腺内分泌前体细胞—胰岛β细胞”发育进程中不同阶段分子表型的认识,将候选的小分子化合物分为对应的三组,分别以PDX1、神经元素3（neurogenin-3,NGN3）和胰岛素的表达高低作为小分子化合物诱导能力的评价指标,筛选出有效的针对不同发育阶段的小分子化合物的组合,为基于球形克隆细胞为“起始细胞”的胰向分化体系的建立准备条件。本课题的研究实现了对胆囊上皮干性细胞基本特性的认识,发现这些干性细胞是比较理想的糖尿病β细胞替代治疗的诱导起始细胞,同时,建立了一个全新的胰向分化的化学诱导体系。在这些进展中,主要的发现有:1)胆囊与胰腺存在紧密的生物学联系,胆囊明显表达胰腺相关特征。在胰腺前体细胞标志物表达方面,胆囊上皮有差异地表达以PDX1、SOX17、FOXA2和SOX9为代表的胰腺前体细胞标志物,且这些标志物在胆囊颈部表达较高,而在胆囊底部表达较少或无表达。而在胰腺内、外分泌相关特征表达方面,胆囊颈部和底部均未见明显胰岛素表达,淀粉酶则见于胆囊底部,胆囊颈部未见明显表达;2)三维培养体系能够支持胆囊上皮细胞生长,并形成大量由较大核质比的单层细胞组成的具有中空结构的球形克隆,这些克隆可以连续传代培养10代以上。而且,三维培养能够获得数量可观的子代细胞,经由连续4周的传代培养可以将细胞数量由起始的104数量级提升到108数量级;3)球形克隆细胞均表达典型的上皮细胞标志,如Ep CAM和CK19,而以Ep CAM为标志进行流式分析,细胞阳性率为99.98%,表明球形克隆仅来源于胆囊上皮成分。同时,球形克隆细胞呈现极性生长方式,具有明显的顶-基底极性,细胞在朝向克隆中心空腔的一面表达顶端极性标志黏蛋白-1（mucin-1）和蛋白激酶C家族ζ异型体（protein kinase Cζ）,而在与基质胶接触的基底面表达层黏连蛋白α1（lamininα1）;4)球形克隆细胞分别经RT-PCR在m RNA水平和免疫荧光染色在蛋白水平进行鉴定,这些细胞除表达胰腺前体细胞标志PDX1、SOX17、SOX9和FOXA2外,还表达其他常见的干性标志物,如LGR5、CD133等。另外,在以经典的胰腺干细胞标志乙醛脱氢酶1（acetaldehyde dehydrogenase 1）催化无色荧光底物发光的荧光示踪实验中,绿色荧光均匀分布在整个克隆中,显示出干性细胞标志在球形克隆分布的均一性;5)分别以胰腺前体细胞标志PDX1,胰腺内分泌前体细胞NGN3和胰岛β细胞特有标志胰岛素的表达为评价指标,筛选出了PDX1诱导剂BRD7552、Notch信号通路抑制剂DBZ和以及甲状腺素T3的小分子化合物组合。以该化合物组合处理球形克隆,在m RNA水平上经q PCR验证,与未分化细胞相比,诱导分化后的细胞主要的胰岛β细胞标志的表达均有明显升高:PDX1升高了47倍,同源盒蛋白NKX6.1（NK homeobox factor 6.1）升高了56倍,神经源分化因子1（neuronal differentiation 1）升高了41倍,胰腺内分泌前体标志NGN3升高了139倍,胰岛素升高了185倍。这些结果也在蛋白层面经免疫荧光染色得到了证实。综上所述,本课题的研究证实了人消化系统内的胆囊与胰腺的生物学背景之间存在一种潜在的联系,胆囊上皮干性细胞具有一定相似于胰腺前体细胞的基本特性,是比较理想的糖尿病β细胞替代治疗的诱导起始细胞,而且,胆囊似乎可以视为胰腺前体细胞的“储备池”;证明了体外三维培养可以支持胆囊上皮干性细胞的生长,并能扩增出足够数量的具有胰腺前体细胞特征的胆囊上皮干性细胞;以这种细胞作为胰向诱导分化的起始细胞,建立了基于“PDX1诱导剂BRD7552、Notch信号通路抑制剂DBZ和甲状腺素T3”小分子化合物组合的新的、有效的胰向诱导分化体系。这些结果的取得,在一定程度上明了了胆囊上皮干性细胞潜在的应用前景,也为临床糖尿病的β细胞替代治疗提供了新的思路。
王雪姣[7]（2020）在《葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究》文中研究表明背景:心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）作为世界上危害人类尤其是中老年人生命健康的主要疾患之一,因其极高的发病率以及近年来的年轻化趋势,而备受广大医者和学者的关注。急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）作为心血管疾病中重要一员,其科学实验及临床治疗的研究更是成为热点和难点。已经发育成熟的心肌细胞作为终末分化细胞,当发生心肌梗死时,心肌细胞不同程度受损甚至坏死,功能丧失。临床对于AMI的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗等,都是针对心肌梗死早期用于挽救受损但是还未凋亡的心肌细胞及其功能,但对于已经坏死或凋亡的心肌细胞却是回天乏术。心肌细胞坏死或凋亡,功能性心肌细胞由无功能的成纤维细胞取代进而形成瘢痕组织,心室重构,心脏功能下降,最终导致心力衰竭,导致患者生活质量下降,严重的威胁患者生命。由于心肌细胞损伤的不可逆性,解决心肌细胞的缺失成为心肌梗死治疗的根本问题。随着科学技术的进步,细胞生物工程学的发展使干细胞替代疗法成为治疗心肌梗死的一种新的具有前景的治疗方法。干细胞具有自我复制和多向分化的能力,使干细胞移植治疗心肌梗死成为研究热点。多项基础实验和临床试验已经表明干细胞移植能够修复受损的心肌细胞,促进血管新生,减少梗死面积,促进心脏功能的恢复。自2003年美国FDA率先批准对心肌梗死等疾病采用自体骨髓干细胞移植进行治疗,此后全球范围内开始了干细胞治疗的相关研究,骨髓间充质干细胞是其中应用最为广泛和成熟的。骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs）与胚胎干细胞等其他干细胞相比以下优点:具有容易获取,容易分离,体外培养及扩增具有稳定性,没有免疫排斥问题,不涉及医学伦理道德问题,具有多向分化潜能,运用恰当的诱导剂在适当条件下可以分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、内皮细胞、干细胞、平滑肌细胞、心肌样细胞,上述优点使其成为了干细胞移植治疗心肌梗死等心血管疾病的重要种子细胞。BMSCs可以通过与心肌细胞共培养,基因修饰及药物诱导等方法分化为心肌细胞,但其分化率及安全性有待进一步提高。葛根素是葛根的重要成分,它可以影响骨髓间充质干细胞的分化。葛根素及其多种制剂已经通过各种药剂形式广泛应用于临床各种心血管疾病的治疗。葛根素作为中药有效成分,与西药相比,毒副作用更小,使用更安全,临床推广价值显着。目前已有研究发现,葛根素不仅能保护受损心肌细胞、保护心血管,还能在体外诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞,提高心室细胞分化效率。目的:本实验应用葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞,从形态学和分子生物学层面探讨葛根素对骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导能力,通过其诱导分化最适浓度的筛选提高分化率,为心肌梗死等心血管疾病的干细胞移植治疗提供理论基础。方法与结果:为了探讨葛根素诱导BMSCs分化为心肌样细胞的可行性,运用全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠的四肢骨的BMSCs。对第2代BMSCs分别运用0（对照组）、50、100、200μmol/L葛根素进行体外定向诱导。观察培养细胞的形态,结果可见,BMSCs由0小时的悬浮状态到24小时时均匀贴壁;3天后可见细胞圆钝突起;7天后细胞呈现长梭形等不规则状态。葛根素诱导7天后,细胞增殖加快,细胞形态更加修长;诱导28天后,细胞呈现方向性的紧密排列状态。BMSCs的形态经过不同浓度葛根素诱导无差异。运用流式细胞技术对第3代BMSCs进行表面抗原鉴定,结果显示,CD29、CD45、CD90的阳性率表达分别为95.1%、7.4%和93.4%。表明细胞为纯化的BMSCs。运用免疫细胞化学检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在诱导4周后各组的表达。结果显示,各诱导组均可见Cx43、c Tn I及c Tn T的阳性表达,空白对照组表达呈阴性,其中100μmol/L诱导组较其他组的阳性表达最高,差异具有统计学意义（P<0.05）。运用激光共聚焦荧光技术检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）,对比诱导4周后对照组与100μmol/L诱导组的表达,提示100μmol/L诱导组呈阳性表达,对照组呈阴性表达,差异显着。运用Western blotting检测法检测间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白I（c Tn I）、心肌肌钙蛋白T（c Tn T）在各组诱导4周的BMSCs的表达。结果显示,各组均在蛋白水平表达Cx43、c Tn I及c Tn T,其中100μmol/L诱导组的表达最高,对照组最低,差异有统计学意义（P<0.05）。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）技术检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌细胞增强因子2c（MEF2c）在各诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达,检测T-box5和amphiphysin-2（Bin1）在空白对照组与100μmol/L诱导组诱导分化1周、2周、4周细胞的表达。结果显示,经葛根素诱导后,各个基因的表达与对照组相比整体呈现上升趋势。虽然各个基因的最高表达量呈现在不同时间段,但都出现在100μmol/L诱导组。各诱导组相比,GATA-4的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时,MEF2c的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导2周时。100μmol/L诱导组与空白对照组相比,T-box5的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导1周时,Bin1的最高表达量出现在100μmol/L诱导组诱导4周时。相较于其他诱导组,100μmol/L组表达最高（P<0.05）。结论:1.采用全骨髓贴壁法分离培养的SD大鼠四肢骨髓细胞可以纯化为骨髓间充质干细胞。2.不同浓度葛根素可以在体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。3.100μmol/L为葛根素体外诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度。
李洁[8]（2020）在《人胚胎干细胞衍生MSC对T淋巴细胞功能调节潜力的研究》文中研究表明间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）除了具有其干细胞特性以外还具有免疫调节特性而成为颇具临床应用价值的治疗性细胞。胚胎干细胞（Human Embryonic Stem Cell,hESC）是一种在体外可无限增殖的亚全能细胞,具有分化成各种体细胞的潜力,因此如果胚胎干细胞能分化成间充质干细胞则该细胞（hESCMSC）将是一种可再生的MSC,而且由于来源相同,hESC-MSC品质高度均一,可望成为质量完全可控的新型MSC产品以用于临床治疗。尽管目前hESC-MSC分化方案多种多样,但是分化效率相差较大,特别是其免疫调节的特性目前仍存在争议。hESC-MSC分化可使用生物基质材料替代细胞饲养层维持人类胚胎干细胞存活并辅助诱导分化,避免了动物源基质细胞对临床研究造成困难。生物基质材料具有无毒、无病原体、生物相容性良好等优势,是诱导hESC-MSC的理想媒介和微环境。不同包被材料通过识别细胞表面受体信号,在培养过程中对hESC-MSC迁移、增殖、分化等具有重要的意义,但对T淋巴细胞免疫调节特性影响鲜见报道。为此我们首先建立了一个简易、高效的hESC-MSC分化方案,并针对该hESC-MSC的免疫调节特性进行了探索,结果表明该hESC-MSC比脐带间充质干细胞（UC-MSC）具有更强烈的对T淋巴细胞增殖的抑制和促进Treg分化的免疫调节功能,提示hESC-MSC可成为更有效的细胞制剂运用于治疗免疫相关的病症。我们进而又在已建立的hESC-MSC分化方案基础上通过改变四种包被材料（明胶/胶原蛋白/透明质酸/纤连蛋白）制备出符合间充质干细胞定义标准的hESC-MSCs,并对这四种来源hESCMSCs的免疫调节特性进行了深入研究。结果表明,透明质酸和明胶两种基质包被分化的hESC-MSC对T淋巴细胞增殖的抑制和促进Treg分化的免疫调节功能优于其他包被材料,并且更强于脐带间充质干细胞（UC-MSC）。本研究证实了明胶、透明质酸两种包被材料分化的hESC-MSCs具有更强免疫调节潜力,有望成为临床免疫治疗种子细胞的首选;两种包被材料是影响hESC-MSC免疫调控能力至关重要的环节,为今后免疫试验研究中细胞培养材料的选择提供了数据支持,并在组织工程和生物医学领域中具有很大的应用价值。
陈博雯[9]（2020）在《鸡PGCs体外诱导形成SSCLCs与减数分裂启动机制研究》文中研究表明原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）是配子发生的祖细胞,配子发生涉及多步复杂的过程,但是关于家禽精子的发生过程与机制至今仍不清楚。近年来,种鸡繁殖力持续下降的问题始终困扰家禽产业的发展。研究表明,每年有5-12%的种公鸡因产精能力低下遭到淘汰,种鸡出苗率下降,呈现“倒挂”趋势,这与种公鸡精子发生密切相关。其次,转基因鸡作为生物反应器具有巨大的潜力,可用于生产高价值的药用蛋白;采用人工改造的方法对PGCs进行外源基因引入,再通过体外诱导产生成熟精子是生产转基因鸡和生物反应器的主要方式之一。因此,通过体外诱导体系研究可以重现家禽体内精子发生过程中PGCs分化形成精子的精确过程,进而建立禽类精子发生机制研究的重要平台。本文将体外培养的鸡PGCs诱导分化形成精原干细胞样细胞（Spermatogonial Stem Cells Like Cells,SSCLCs）,并启动减数分裂过程,探明诱导过程中基因表达变化的动态图谱,为进一步深度解析禽类精子发生过程和转基因鸡生产奠定基础。试验结果如下:1、为得到体外培养的鸡PGCs,试验首先利用胰蛋白酶消化4.5-5.5 d鸡胚性腺,成功分离并使用有饲养层培养基培养得到鸡PGCs;为了提高体外培养的PGCs纯度和增殖效率,试验通过添加适用于干细胞无饲养层培养的细胞因子对有饲养层培养基进行改良,配置成无饲养层培养基。结果表明,在优化后的无饲养层培养基中,连续培养4d后PGCs呈小团聚集,培养7d后大量PGCs聚集在一起,这种聚集现象比在有饲养层培养系统中更明显,更有利于PGCs的短期快速增殖和更新（25 d）,且纯度较高（40%以上）;且发现同时添加B27、CS和N2三种细胞因子有利于PGCs的体外增殖和更新;细胞免疫荧光染色证明,有、无饲养层培养基体外培养的PGCs仍保持多能性和生殖特性且未发生分化,为后续PGCs体外诱导分化做好准备。2、为探究细胞因子bFGF和GDNF对鸡PGCs的体外诱导作用,试验通过在诱导培养基中分别添加bFGF和GDNF对鸡PGCs进行体外诱导。流式细胞分析发现,与同时添加bFGF和GDNF组相比,不添加bFGF/GDNF组和单独添加bFGF或GDNF组双阳性SSCLCs 比例均显着降低（P<0.05）;且荧光定量PCR检测结果发现,同时添加bFGF和GDNF因子后CVH、ITGA6基因表达均显着高于其他两组（P<0.05）,且减数分裂启动基因STRA8高表达,说明细胞因子bFGF和GDNF对PGCs的诱导分化具有重要作用。鉴于以上试验结果,确定了含有重要细胞诱导因子bFGF和GDNF的鸡PGCs体外分化形成SSCLCs且进入减数分裂的体外诱导体系。3、为阐明鸡PGCs体外诱导过程中双阳性SSCLCs 比例变化及基因表达变化的动态图谱,首先使用上述构建的体外诱导体系对有饲养层培养基培养的鸡PGCs进行体外诱导。结果发现,诱导24h后出现Integrin-α6阳性SSCLCs,诱导48 h后Integrin-β1和SSEA-1双阳性SSCLCs的比例最高达到27.9%;荧光定量PCR分析结果发现,OCT4基因在诱导48 h后显着降低（P<0.05）,生殖标志基因DAZL和ITGB1在诱导72 h后表达量显着升高（P<0.05）,说明诱导后细胞逐渐退出多能性和自我更新状态,而生殖标志基因高表达,即朝着生殖方向分化;同时减数分裂启动基因STRA8在诱导48 h后显着上升（P<0.05）,诱导72 h又呈现下降趋势;联会复合体基因SYCP3在诱导48 h表达下降,但差异不显着,而诱导72h表达量又显着升高（P<0.05）,说明PGCs诱导后细胞已启动减数分裂活动,并且已经处于减数分裂I期,正在发生同源重组等重要的生物学事件。同样,无饲养层培养基培养的PGCs体外诱导分化形成SSCLCs过程中细胞逐渐退出多能性状态,而生殖标志基因CVH、ITGB1高表达,减数分裂标志基因STRA8和SYCP3也高度表达,标志细胞进行减数分裂;且无饲养层培养系统在本实验诱导体系下体外诱导效果更佳（效率提高了 24%）。4、为探究不同性别PGCs在诱导分化中因相互干扰对形成SSCLCs的效率的影响,分别诱导雄性和雌雄混合的PGCs,发现两组中SSCLCs的比例均随着诱导时间的延长而增大,雌雄混合PGCs中双阳性SSCLCs的比例在诱寻72h后比雄性FGCs组中高13.8%,说明在此诱导体系条件下,雌性PGCs对雄性PGCs体外分化形成SSCLCs具有促进作用。综上可知,鸡PGCs在同时含有重要诱导分化因子bFGF和GDNF的诱导培养基中体外分化为SSCLCs,成功建立了鸡PGCs分化为SSCLCs的体外诱导分化体系,诱导后的细胞进入减数分裂活动;无饲养层培养基更有利于PGCs的增殖和更新,诱导分化为SSCLCs效率更高;且雌性PGCs对雄性PGCs体外分化形成SSCLCs具有促进作用。
李昌[10]（2020）在《单细胞测序解析体外特化的猴原始生殖细胞样细胞发育路径》文中进行了进一步梳理生殖细胞谱系起源于发育早期,经历了一系列复杂的发育过程,最终产生完全成熟的配子（精子和卵母细胞）。在哺乳动物中,生殖细胞谱系在发育早期通过信号分子诱导成多能前体细胞。原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞谱系的基础群体,随后在胚胎和出生后经历高度复杂的发育,最终根据个体的性别分化为卵母细胞或精子。生殖细胞发育过程中发生的关键事件包括表观遗传重编程和减数分裂重组,它们分别创造了新一代的表观遗传和遗传多样性。值得注意的是,研究人员一直在利用老鼠和人类的多能干细胞（PSCs）重述这些发育途径,这些研究清晰的解析了小鼠和人类生殖细胞发育机制的关键物种差异,突显了在其他哺乳动物（如非人类灵长类）中建立体外生殖细胞发育系统的必要性。随着进一步的研究,包括那些涉及非人类灵长类动物模型的研究,人类配子发生可能完全由多能干细胞重构,这将深刻地促进我们对人类生殖细胞发育和不孕不育的理解。研究目的:1)从灵长类多能干细胞中诱导出原始生殖样细胞为研究难以在体内研究的生殖谱系分化的细胞和分子机制提供了有力的系统。2)对原始生殖样细胞分化的发育轨迹进行全面的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。3)解析原始生殖样细胞特化所需的微环境。结果显示:应用拟胚体（EB）分化系统从雄性和雌性猴的na?ve状态的多能干细胞中诱导出原始生殖样细胞,用高通量scRNA-seq分析方法对na?ve细胞和拟胚体内的细胞类型进行分析。解释了拟胚体通过分泌对PGCLCs特化至关重要的生长因子,如BPM2、BMP4和WNT3,为原始生殖样细胞的分化提供了一个有利环境。此外,本论文重建了原始生殖样细胞的发育轨迹,揭示了基因表达的动态变化。
二、胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化（论文提纲范文）
（1）hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建及转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒的包装 |
| 2.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒载体的构建 |
| 3.2 慢病毒转导hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC的转导效率 |
| 4 结论 |
| 第二部分 GFP+MSCs细胞系的建立及培养与传代 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GFP+MSCs的形态观察和GFP表达情况 |
| 2.2 GFP+MSCs的培养和传代 |
| 3 讨论 |
| 3.1 GFP+MSCs细胞系的建立 |
| 3.2 GFP+MSCs的传代和培养 |
| 4 结论 |
| 第三部分 hESC-MSC、hADSC、hUC-MSC标记GFP基因前后特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 2.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化情况 |
| 2.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 MSCs标记GFP基因前后增殖力比较 |
| 3.2 MSCs标记GFP基因前后体外诱导分化能力评估 |
| 3.3 MSCs标记GFP基因前后细胞表型的表达情况 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 荧光蛋白法标记在间充质干细胞中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 原始生殖细胞(PGCs) |
| 1.1.1 鸡PGCs的起源和迁移 |
| 1.1.2 鸡PGCs的分离和培养 |
| 1.1.3 PGCs细胞的体外诱导 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 细胞重编程 |
| 1.2.1 细胞重编程的研究进展 |
| 1.2.2 体细胞诱导重编程的分子机制 |
| 1.2.3 体细胞诱导重编程体系的优化 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞的应用 |
| 1.3 本课题前期研究发现 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡CEF诱导重编程为iPS |
| 2.1.5 鸡iPS的鉴定 |
| 2.1.6 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.1.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.1.8 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用 |
| 2.1.9 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鸡CEF诱导重编程为iPS及鉴定 |
| 2.2.2 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.2.3 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.2.4 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用研究 |
| 2.2.5 小分子化合物2i-SP优化鸡iPS诱导体系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 细胞分离纯化 |
| 3.1.5 RNA抽提和质量检测 |
| 3.1.6 cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.7 RNA-seq数据分析步骤 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA样品检测结果 |
| 3.2.2 测序数据产出统计 |
| 3.2.3 参考序列比对分析 |
| 3.2.4 RNA-seq整体质量评估 |
| 3.2.5 不同体系诱导的iPS细胞相关性分析 |
| 3.2.6 不同体系诱导的iPS细胞差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中差异表达基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 鸡iPS/ESCs诱导分化为iPGCs |
| 4.1.5 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化研究 |
| 4.1.6 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组测序 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡iPS诱导分化为iPGCs |
| 4.2.2 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化 |
| 4.2.3 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组学研究 |
| 4.2.4 鸡iPGCs (iPS-derived)与PGCs差异表达基因功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 鸡iPGCs介导类克隆体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.1.5 类克隆鸡微卫星检测 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.2.2 微卫星检测类克隆鸡品种关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论与创新点 |
| 论文有待进一步深入研究的问题 |
| 附录 |
| 原始数据表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（4）KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 原始生殖细胞在体内的发育及特化机制 |
| 1.1.1 mPGC体内发育、特化及表观重编程 |
| 1.1.2 hPGC体内发育及特化机制 |
| 1.2 体外诱导ESC成原始生殖细胞样细胞 |
| 1.2.1 体外诱导mESC成有功能的配子 |
| 1.2.2 体外诱导hESC成原始生殖细胞样细胞 |
| 1.2.3 利用PGCLC研究生殖细胞分化调控机制 |
| 1.3 表观遗传调控对PGC发育的影响 |
| 1.3.1 表观遗传学的定义 |
| 1.3.2 表观基因组的重编程 |
| 1.3.3 DNA甲基化对生殖细胞发育的影响 |
| 1.3.4 组蛋白甲基化修饰对早期PGC发育的影响 |
| 1.3.5 组蛋白赖氨酸去甲基化酶(KDMs)对精子发生的影响 |
| 1.4 KDM2B的研究进展 |
| 1.4.1 KDM2B在体细胞重编程中的作用 |
| 1.4.2 KDM2B在体细胞分化中的作用 |
| 1.4.3 KDM2B对生殖细胞发育的影响 |
| 1.5 本研究的意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及细胞 |
| 2.1.2 实验用质粒和重组慢病毒载体 |
| 2.2 实验仪器、试剂和耗材 |
| 2.2.1 分子克隆实验试剂的配制 |
| 2.2.2 细胞实验相关试剂以及培养基的配制 |
| 2.2.3 免疫荧光相关试剂及配制 |
| 2.2.4 Western Blotting等生化实验相关试剂及配制 |
| 2.2.5 主要抗体列表 |
| 2.2.6 主要引物列表 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人类胚胎干细胞的培养及原始生殖细胞样细胞的诱导分化 |
| 2.3.2 大肠杆菌DH5-α感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 利用CRISPR/Cas9技术建立KDM2B敲除的hES细胞系 |
| 2.3.4 Dox诱导KDM2B表达细胞系的建立 |
| 2.3.5 质粒大提 |
| 2.3.6 核型分析 |
| 2.3.7 总RNA的提取 |
| 2.3.8 mRNA逆转录合成cDNA |
| 2.3.9 定量PCR检测 |
| 2.3.10 Western blotting |
| 2.3.11 细胞增殖检测 |
| 2.3.12 冰冻切片 |
| 2.3.13 免疫荧光染色 |
| 2.3.14 小鼠畸胎瘤的诱导及石蜡包埋切片 |
| 2.3.15 苏木精和伊红染色 |
| 2.3.16 流式细胞分选 |
| 2.3.17 RNA-seq及数据分析 |
| 2.3.18 统计学处理 |
| 第3章 第一部分结果：KDM2B参与调控生殖细胞特化 |
| 3.1 KDM2B在人类胎儿生殖细胞及hPGCLC中高表达 |
| 3.2 pX330-EGFP-KDM2B重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3 构建KDM2B敲除的人类胚胎干细胞系 |
| 3.4 KDM2B缺失的hESC中H3K4me3全局水平增高 |
| 3.5 缺失KDM2B不影响hESC的自我更新能力 |
| 3.6 缺失KDM2B对hESC向三胚层分化没有明显影响 |
| 3.7 KDM2B的耗竭损害了hPGCLC的分化 |
| 3.8 讨论 |
| 第4章 第二部分结果:KDM2B通过调控早期转录组的转变,促进hPGCLC分化 |
| 4.1 缺失KDM2B的hES细胞功能发生了紊乱 |
| 4.2 KDM2B KO Day 1hPGCLC中体细胞基因的表达异常上调 |
| 4.3 缺失KDM2B引起表观遗传因子改变 |
| 4.4 KDM2B KO Day 2hPGCLCs中多能性基因的表达异常 |
| 4.5 KDM5B在男性胎儿生殖细胞及hPGCLC中高表达 |
| 4.6 PX330-EGFP-KDM5B重组质粒的构建及鉴定 |
| 4.7 构建KDM5B敲除的人类胚胎干细胞系 |
| 4.8 缺失KDM5B对hESC关键多能基因的表达没有明显影响 |
| 4.9 KDM5B在hPGCLC的分化中无关紧要 |
| 4.10 讨论 |
| 第5章 第三部分结果:表达外源性KDM2B能有效挽救hPGCLC的分化受损 |
| 5.1 TetO-FUW-KDM2B重组质粒的构建及鉴定 |
| 5.2 慢病毒包装TetO-FUW-KDM2B重组质粒及鉴定病毒效果 |
| 5.3 TetO-FUW-KDM2B病毒感染hESC构建稳定细胞株 |
| 5.4 Dox诱导外源性KDM2B的表达呈WT内源性水平 |
| 5.5 诱导表达外源性KDM2B恢复了hPGCLC的分化效率 |
| 5.6 讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心血管疾病的研究现状 |
| 1.1.1 心血管疾病的发病原因及危害 |
| 1.1.2 心血管疾病的治疗及面临的挑战 |
| 1.2 干细胞 |
| 1.2.1 干细胞概述 |
| 1.2.2 胚胎干细胞 |
| 1.2.3 成体干细胞 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞 |
| 1.3 心脏组织工程 |
| 1.3.1 体外心肌细胞的来源 |
| 1.3.2 生物材料支架在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.3.3 力的测量在心脏组织工程方面的应用 |
| 1.4 本论文的主要研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 体外诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 人诱导多能干细胞的培养及表征 |
| 2.2.3 小分子诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.4 心肌分化试剂盒诱导人诱导多能干细胞向心肌细胞方向分化 |
| 2.2.5 心肌细胞的表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 人诱导多能干细胞的形态特征 |
| 2.3.2 小分子诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.3.3 心肌分化试剂盒诱导分化所得的心肌细胞的形态及收缩性能 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于人头发丝的三维平台用于体外工程化心肌组织的长期培养 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 人头发丝的形态表征 |
| 3.2.3 心肌细胞的形态表征 |
| 3.2.4 基于人头发丝的三维细胞培养平台的搭建 |
| 3.2.5 基于人头发丝平台的体外工程化心肌组织的构建及长期培养 |
| 3.2.6 体外工程化心肌组织的表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 人头发丝的微观形态 |
| 3.3.2 心肌细胞的形态 |
| 3.3.3 体外工程化心肌组织的形态随时间的变化 |
| 3.3.4 体外工程化心肌组织的收缩性能随时间的变化 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于人头发丝弹簧的三维平台用于体外心肌组织的培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 人头发丝弹簧的制备 |
| 4.2.3 两种基于人头发丝弹簧的三维平台的搭建 |
| 4.2.4 基于人头发丝弹簧的体外心肌组织的构建与培养 |
| 4.2.5 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能的表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于人头发丝弹簧的支架的制备 |
| 4.3.2 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的构建 |
| 4.3.3 基于人头发丝弹簧的体外工程化心肌组织的收缩性能 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 人头发丝弹簧用于体外心肌组织收缩力测量的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.2.3 人头发丝弹簧的弹性系数的测量 |
| 5.2.4 人头发丝弹簧的循环拉伸试验 |
| 5.2.5 人头发丝弹簧的结构变化表征 |
| 5.2.6 基于人头发丝弹簧的心肌细胞收缩力的测量装置的搭建 |
| 5.2.7 体外工程化心肌组织的培养及其收缩力的测量 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的制备 |
| 5.3.2 不同直径和不同长度的人头发丝弹簧的弹性系数测量结果 |
| 5.3.3 人头发丝弹簧的结构变化 |
| 5.3.4 人头发丝弹簧的1000 次循环拉伸试验结果 |
| 5.3.5 人头发丝弹簧用于体外工程化心肌组织的收缩力测量的结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文总结 |
| 6.2 论文的创新点 |
| 6.3 论文的后续工作及展望 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）人胆囊上皮干性细胞体外诱导为胰腺β样细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、人胆囊组织上皮细胞分子特性的鉴定 |
| 二、人胆囊上皮细胞体外三维培养体系的建立 |
| 三、培养的球形克隆上皮特性及极性分析 |
| 四、球形克隆胰腺前体细胞相关特性分析 |
| 五、球形克隆细胞向胰岛β细胞方向的诱导分化 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 类器官的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞适用于心血管疾病治疗的特性及其发挥作用的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）人胚胎干细胞衍生MSC对T淋巴细胞功能调节潜力的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRCT |
| 第一章 综述 |
| 1.1 间充质干细胞的研究现状 |
| 1.1.1 间充质干细胞应用于免疫疾病治疗 |
| 1.1.2 间充质干细胞应用于组织修复和抗衰老治疗 |
| 1.1.3 间充质干细胞应用于组织工程研究 |
| 1.2 人胚胎干细胞的研究现状 |
| 1.3 人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的研究现状 |
| 1.4 间充质干细胞对T淋巴细胞免疫调节研究 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 人胚胎干细胞衍生间充质干细胞的分化与鉴定 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 细胞培养 |
| 2.1.2 细胞冻存与复苏 |
| 2.1.3 hESC-MSC分化方案 |
| 2.1.4 MSC成骨、成脂、成软骨诱导分化 |
| 2.1.5 MSC增殖检测 |
| 2.1.6 流式细胞仪检测细胞表面抗原表达 |
| 2.1.7 RNA提取与反转录 |
| 2.1.8 荧光定量PCR(Real-time PCR)反应 |
| 2.1.9 统计与分析 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 hESC-MSC的分化与细胞表面抗原表达 |
| 2.3.2 hESC-MSC的成骨、成脂、成软骨分化 |
| 2.3.3 hESC-MSC增殖检测 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 人胚胎干细胞衍生MSC具有强烈的CD4~+-T淋巴细胞功能调节潜力 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 细胞冻存与复苏 |
| 3.1.3 hESC-MSC分化方案 |
| 3.1.4 流式细胞仪进行细胞表面抗原表达检测 |
| 3.1.5 CD4~+T淋巴细胞增殖检测 |
| 3.1.6 CD4~+T淋巴细胞向Treg分化检测 |
| 3.1.7 统计与分析 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 hESC-MSC在不同共培养条件下对CD4~+T淋巴细胞增殖的抑制 |
| 3.3.2 hESC-MSC在不同共培养条件下促进CD4~+T淋巴细胞向Treg细胞分化 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 hESC通过不同包被材料衍生的MSC生物学特性鉴定 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.2 细胞冻存与复苏 |
| 4.1.3 hESC-MSC分化方案 |
| 4.1.4 MSC成骨、成脂、成软骨诱导分化 |
| 4.1.5 流式细胞仪进行细胞表面抗原表达检测 |
| 4.1.6 RNA提取与反转录 |
| 4.1.7 荧光定量PCR(Real-time PCR)反应 |
| 4.1.8 统计与分析 |
| 4.2 实验仪器与试剂 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 不同包被材料分化的hESC-MSC表面抗原表达 |
| 4.3.2 不同包被材料分化的hESC-MSC成骨、成脂、成软骨分化能力 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 不同包被材料对hESC-MSC在 T淋巴细胞免疫功能调节的影响 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 细胞冻存与复苏 |
| 5.1.3 hESC-MSC分化方案 |
| 5.1.4 流式细胞仪检测细胞表面抗原表达 |
| 5.1.5 T淋巴细胞增殖检测 |
| 5.1.6 T淋巴细胞向Treg分化检测 |
| 5.1.7 ELISA检测MSC分泌抗炎因子 |
| 5.1.8 统计与分析 |
| 5.2 实验仪器与试剂 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 不同包被材料对hESC-MSC抑制T淋巴细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 不同包被材料对hESC-MSC促进Treg分化的影响 |
| 5.3.3 不同包被材料对hESC-MSC在不同共培养条件下抗炎因子分泌的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（9）鸡PGCs体外诱导形成SSCLCs与减数分裂启动机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鸡原始生殖细胞的研究进展 |
| 1.1.1 鸡原始生殖细胞的来源 |
| 1.1.2 鸡PGCs的生物学特征 |
| 1.1.3 鸡PGCs的形态特征 |
| 1.1.4 鸡PGCs的鉴定 |
| 1.1.5 禽类PGCs的发育和迁移 |
| 1.1.6 鸡PGCs的体外培养 |
| 1.1.7 PGCs增殖的影响因素及机制 |
| 1.2 PGCs的分化及精子发生研究进展 |
| 1.2.1 精原细胞的自我更新、分化及参与的信号通路 |
| 1.2.2 鸡性别分化和SSCs的管内移植 |
| 1.2.3 精母细胞的基因表达特征 |
| 1.2.4 减数分裂前的相关基因 |
| 1.2.5 减数分裂过程中的相关基因调控 |
| 1.3 PGCs向精细胞诱导分化的研究进展 |
| 1.3.1 干细胞定向分化的方法 |
| 1.3.2 细胞体外诱导分化体系的建立 |
| 1.3.3 体外诱导技术 |
| 1.3.4 家禽早期胚胎性别鉴定体系的建立 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 鸡PGCs培养体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 有饲养层培养基培养鸡PGCs |
| 2.2.2 PGCs培养体系的优化和改良 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 鸡PGCs的体外诱导分化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 bFGF和GDNF对鸡PGCs的诱导分化作用及诱导体系的建立 |
| 3.2.2 有饲养层培养基中鸡PGCs 体外诱寻形成SSCLCs |
| 3.2.3 无饲养层培养基中鸡PGCs体外诱导形成SSCLCs |
| 3.2.4 不同性别PGCs在诱导分化中对SSCLCs效率的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）单细胞测序解析体外特化的猴原始生殖细胞样细胞发育路径（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 PGC体内特化和体外诱导 |
| 1.2.1 PGC体内特化 |
| 1.2.2 PGC体外诱导 |
| 1.3 PGC特化的转录调节 |
| 1.3.1 Wnt信号和BMP信号 |
| 1.3.2 转录调节因子 |
| 1.4 PGC发育的表观遗传重编程 |
| 1.4.1 组蛋白修饰 |
| 1.4.2 甲基化 |
| 第二章 猴胚胎干细胞的培养和鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验用到的仪器设备 |
| 2.1.3 实验用到的试剂 |
| 2.1.4 实验用到的溶液及培养液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞计数 |
| 2.2.2 小鼠成纤维细胞培养 |
| 2.2.3 利用小鼠成纤维细胞制作饲养层细胞 |
| 2.2.4 na(?)ve状态的胚胎干细胞培养 |
| 2.2.5 胚胎干细胞的免疫荧光检测 |
| 2.2.6 细胞培养支原体检测的方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 猴原始生殖细胞的体外特化和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 实验所用到的设备和耗材 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验用到的培养液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 分化前na(?)ve状态的细胞准备 |
| 3.2.2 PGCLCs体外特化 |
| 3.2.3 EB球的收集和免疫荧光染色鉴定 |
| 3.2.4 EB球realtime鉴定原始生殖细胞样细胞相关标记物 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 单细胞测序解析猴原始生殖细胞发育 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 实验仪器及耗材 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞准备 |
| 4.2.2 10X方法 |
| 4.2.3 测序 |
| 4.2.4 生物信息分析方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 原始生殖细胞特化期间的细胞类型 |
| 4.3.2 原始生殖细胞特化期间的转录调节 |
| 4.3.3 原始生殖细胞特化期间雌、雄转录调控 |
| 4.3.4 原始生殖细胞样细胞发育轨迹解析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与讨论 |
| 第六章 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表的论文目录 |
四、胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化（论文参考文献）
- [1]hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析[D]. 刘云. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究[D]. 袁霞. 扬州大学, 2021
- [3]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [4]KDM2B在人类原始生殖细胞样细胞特化过程中的作用及机制[D]. 袁伟燕. 南方医科大学, 2021(02)
- [5]基于人头发丝支架的体外三维心肌组织的构建及其收缩性能的研究[D]. 肖倩茹. 东南大学, 2020(02)
- [6]人胆囊上皮干性细胞体外诱导为胰腺β样细胞的研究[D]. 杨桃. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]葛根素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究[D]. 王雪姣. 河北北方学院, 2020(06)
- [8]人胚胎干细胞衍生MSC对T淋巴细胞功能调节潜力的研究[D]. 李洁. 山西大学, 2020(01)
- [9]鸡PGCs体外诱导形成SSCLCs与减数分裂启动机制研究[D]. 陈博雯. 扬州大学, 2020
- [10]单细胞测序解析体外特化的猴原始生殖细胞样细胞发育路径[D]. 李昌. 昆明理工大学, 2020(05)