一、应用硫堇染色法对神经元尼氏体进行染色（论文文献综述）
贾巧荣[1]（2021）在《TNF-α-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血模型中的相关研究》文中研究表明目的探究TNF-α-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血（Cerebral ischemia,CI）模型中的作用,并予以常压氧（Normobaric oxygen,NBO）治疗作为干预手段,为该病防治新方案的设计提供理论基础和实验依据。方法1.采用线栓法MCAO建立SD大鼠CI模型以模拟人类临床急性脑梗死。将大鼠随机分为空白对照组（Cont）、假手术组（Sham）、脑缺血模型组（CI）、CI+NF-κB抑制剂BAY11-7082组（CI+BAY）、CI+溶剂对照1%DMSO组（CI+DMSO）、CI+常压氧治疗组（CI+NBO）,每组n=24。2.采用动物行为学评价和2%TTC染色法进行模型验证,并对各组大鼠神经行为学能力和脑梗死灶面积进行对比。3.采用HE、尼氏染色法观察各组大鼠脑海马CA1区神经细胞的形态和分布情况。4.采用实时荧光定量PCR和Western-blot检测各组大鼠脑海马TNF-α、TNFR1、IκB、NF-κB的蛋白和m RNA表达,并结合免疫组织化学染色方法法观察比较各组大鼠顶叶皮质、脑海马CA1区TNF-α的表达及定位。结果1.行为学检测结果:与Cont组和Sham组相比,各模型组大鼠各行为学检测结果均显示脑缺血会造成神经运动功能损伤（p<0.05）;大鼠肢体对称实验和双侧前爪抓握实验结果均显示NF-κB抑制剂干预可加重大鼠病灶对侧神经运动功能损伤,导致肌力进一步减退（p<0.05）;大鼠肢体对称实验和双侧前爪抓握实验结果显示常压氧治疗可减轻病灶对侧神经功能损伤,促进肌力恢复（p<0.05）。2.2%TTC染色结果:与Cont组和Sham组相比,各模型组大鼠均出现了白色梗死灶,且各模型组之间相比脑梗死灶的面积大小无明显差异（p>0.05）,表明脑缺血模型建立成功,脑缺血区域面积大小较稳定;而抑制剂和氧疗法的干预均未导致脑梗死面积出现明显变化。3.组织形态学检测结果:HE染色和尼氏体染色结果较为一致,二者均显示:与Cont组和Sham组相比,各模型组大鼠海马CA1区均出现锥体细胞排列疏松紊乱,部分细胞体积缩小,核不规则固缩,胞质深染且有胶质瘢痕形成,尼氏体减少,染色变淡等现象;与CI+DMSO组相比,CI+BAY组大鼠海马CA1区锥体细胞层数明显减少且排列散乱,大部分锥体细胞变性坏死,胞核固缩变形严重,胞质浓染,残存细胞尼氏体缺失;与CI组相比,CI+NBO组大鼠脑海马CA1区锥体细胞排列相对整齐,小部分细胞体积变小,出现胞质深染结构不清和嗜酸性变的细胞数量明显减少,尼氏体数量增多,染色相对加深。4.免疫组织化学染色方法结果:TNF-α蛋白的表达水平在各组大鼠顶叶皮质和脑海马CA1区结果变化较一致,各模型组大鼠TNF-α免疫阳性细胞数明显增多（p<0.05）;与CI+DMSO组相比,CI+BAY组大鼠海马CA1区TNF-α免疫阳性细胞数明显增多（p<0.05）;与CI组相比,CI+NBO组大鼠顶叶皮质区和海马CA1区TNF-α免疫阳性细胞数明显减少（p<0.05）。5.蛋白免疫印迹检测结果:与Cont组和Sham组相比,各模型组大鼠脑海马内TNF-α、TNFR1、IκB及NF-κB的蛋白表达水平均明显增高（p<0.01）;与CI+DMSO组相比,CI+BAY组大鼠海马TNF-α、TNFR1、IκB及NF-κB蛋白表达水平均明显增高（p<0.05）;与CI组相比,CI+NBO组大鼠海马TNF-α、NF-κB蛋白表达水平明显降低（p<0.05）,TNFR1蛋白水平明显升高（p<0.05）。6.实时荧光定量PCR检测结果:与Cont组和Sham组相比,各模型组大鼠海马TNF-α、TNFR1、NF-κB及IκB的m RNA表达水平均明显增高（p<0.05）;与CI+DMSO组相比,CI+BAY组大鼠海马TNF-αm RNA水平明显降低p<0.05),TNFR1、NF-κB及IκB的m RNA表达水平均明显增高（p<0.05）;与CI组相比,CI+NBO组大鼠海马内TNF-α、TNFR1及IκB m RNA表达水平明显增高（p<0.05）。结论1.线栓法MCAO能够成功建立脑缺血面积稳定的CI大鼠模型。2.CI大鼠脑海马神经元缺血损伤及神经行为学功能障碍可能与TNF-α的高表达有关,TNF-α是CI病理机制中重要的炎症效应分子,其主要表达效应与TNF-α-TNFR1-IκB-NF-κB通路相关,NF-κB信号通路在CI炎症反应的病理过程中扮演着重要的角色。3.NBO疗法对于CI的病理过程有一定的保护作用,该作用可能是通过减低炎症因子TNF-α的高表达及抑制TNF-α-NF-κB炎症信号通路的激活实现的。
浦延鹏[2]（2021）在《基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制》文中研究说明目的:探索眼针对MCAO/R大鼠神经功能缺损的保护作用机制。观察眼针干预后,对MCAO/R大鼠脑组织尼氏体和血管新生的影响,探究眼针能否通过促进尼氏体恢复,促进血管新生,增加Wnt3a、β-catenin、LEF1及HIF-1α因子的表达,以减轻脑损伤,加快神经功能的恢复,希望能够通过此研究为临床眼针治疗缺血性脑卒中提供可靠的研究依据。材料与方法:1动物及分组选用SPF级健康雄性成年SD大鼠,采用随机数字表法将大鼠分为空白组（blank）、假手术组（sham）、模型组（model）、眼针组（eye acupuncture）、针刺组（acupuncture）,每组12只,遵照《关于善待实验动物的指导性意见》（科技部2006年颁布）中动物的使用及伦理学规定。2模型制备方法采用改良线栓法制备大鼠MCAO/R模型,具体方法见正文。3干预方法空白组,不进行干预;假手术组,在行手术后,不再做其他干预措施;模型组,造模成功后,不再做其他干预措施。针刺组,造模成功后,用13mm的毫针,分别取大鼠的百会穴和曲鬓穴,平刺,进针大约3mm,透过真皮达皮下组织,然后开始计时,在10min时和20min时,各刮针柄5下,共留针20min;眼针组,在造模成功后,选取双侧上焦区、下焦区、肝区和肾区进行眼针针刺治疗,主要采用平刺法,深度透过真皮,留针20min。两组针刺皆在脑缺血再灌注一小时后开始,每隔8h针刺一次,在各时间节点前30min,行最后一次针刺治疗,对3h,24h及72h三个时间节点进行评测,取材检测。4指标检测及方法造模前、后及治疗前、后,观察大鼠的一般情况,应用Longa评分法、Bederson评分法及前肢踩空试验三种方法,对大鼠的神经功能进行评测,应用TTC染色法观察大鼠脑梗死的情况,采用尼氏体染色的方法观察大鼠脑组织神经元的变化情况;通过免疫组织化学观察缺血区大脑皮层CD34+的阳性表达变化,另采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达变化;应用免疫组织化学法和Western blot两种方法,检测大鼠脑组织缺血半暗带区域中HIF-1α因子,及Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路相关因子的表达水平。5统计学分析采用SPSS25.0进行统计分析,以均数加减标准差为统计量（x±s）,采用单因素方差分析（One-Way-Anova）进行总体比较,有差异的采用最小显着差异法（LSD）进行两两比较,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1 TTC染色法评价大鼠脑梗死结果显示,空白和假手术组的脑组织呈红色,无明显梗死灶,而模型组则有明显的苍白色梗死灶。2大鼠神经功能障碍评分Longa评分和Bederson评分结果显示,与空白和假手术组比较,模型组大鼠的评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;而空白与假手术组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。3大鼠前肢踩空试验评分变化在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分改变不明显（P>0.05）,差异无统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组评分明显升高（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的评分明显降低（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组评分降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。4大鼠尼氏体染色结果尼氏体染色结果显示,在3h和24h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,与针刺组比较,眼针组尼氏体增加较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;而在72h时间点时,与空白和假手术组比较,模型组尼氏体明显减少（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组的尼氏体明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而空白和假手术组,眼针组和针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。5免疫组织化学法检测大鼠脑组织CD34+的表达在3h时,各组之间CD34+的表达无明显差异（P>0.05）;而在24h和72h时,与空白和假手术组比较,模型组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组CD34+的表达明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组,眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6酶联免疫吸附法检测大鼠血清中VEGFA的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠血清VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组VEGFA的表达明显增多（P<0.05）,且在24h时,眼针组与针刺组比较,眼针组的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义;空白组与假手术组比较,3h和72h时眼针组与针刺组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7 Western blot法检测大鼠脑组织缺血半暗带区域相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,β-catenin,LEF1的表达明显较多,Wnt3a的表达较低（P<0.05）,而HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,Wnt3a,β-catenin的表达明显较多（P<0.05）,而LEF1和HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在72h时,Wnt3a,HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin和LEF1的表达无明显差异（P>0.05）。8免疫组织化学法检测大鼠脑组织相关因子的表达与空白和假手术组比较,模型组大鼠脑组织Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达明显增多（P<0.05）,与模型组比较,眼针组和针刺组Wnt3a,β-catenin,LEF1以及HIF-1α的表达也明显增多（P<0.05）,差异具有统计学意义;眼针组与针刺组比较,在3h时,Wnt3a,β-catenin,LEF1及HIF-1α的表达无明显差异（P>0.05）;在24h时,β-catenin及HIF-1α的表达明显较多（P<0.05）,Wnt3a及LEF1的表达差异无统计学意义（P>0.05）;在72h时,Wnt3a的表达明显较多（P<0.05）,差异具有统计学意义,而β-catenin,LEF1和HIF-1α的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.眼针可以改善MCAO/R大鼠的神经功能缺损,其机制可能是通过改善神经元的损伤,从而促进神经功能的恢复,且疗效好于针刺组。2.眼针可以促进MCAO/R大鼠血清VEGFA的增多,从而促进血管新生,改善脑损伤。3.眼针可以增加MCAO/R大鼠HIF-1α因子及经典Wnt信号传导通路中Wnt3a,β-catenin,LEF1的表达,从而促进血管新生,减轻神经元损伤,促进神经功能的恢复,这可能是眼针治疗缺血性脑卒中的作用机制之一。
石竹砚[3]（2021）在《靶向纳米输递体系用于重大脑部疾病治疗的研究》文中研究指明脑部疾病是发生在脑部的异质性神经和精神障碍。在各类脑部疾病中,以多形胶质母细胞瘤（GBM）为代表的脑部肿瘤、以阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）为代表的脑部神经退行性疾病,全球患病人数高,造成的后果严重,尤其受到关注。现有的药物治疗效果不理想,主要是由于游离药物在病灶/靶点部位的有效药物浓度较低。具体而言,药物的血液循环半衰期较短,药物在病灶部位的富集程度较低,药物对目标部位的靶向能力较差,药物在靶点部位的可控释药能力不足。针对以上问题,论文设计并构建了分别针对GBM、AD和PD的纳米输递体系用于药物和抗原的递送,并且通过体外实验和体内实验考察了体系的输递效率和治疗效果。论文的具体研究内容如下:（1）设计了一种由聚（氨基酸）构建的微环境响应型的纳米输递体系包载抗肿瘤药物阿霉素（DOX）用于GBM的治疗（DOX@PLSPL）。该纳米体系不仅能够延长药物的血液循环半衰期,提高药物在肿瘤病灶部位的富集,而且可以在病灶部位实现可控释药。DOX@PLSPL为水力学粒径约127 nm、形貌较均一的球形胶束。体系具有较高的载药效率（32.5%）和ROS响应释药能力。相较于游离药物DOX,体系显着提高了细胞胞吞效率（药物入胞效率提高1.8倍）。同时,体系具有与游离DOX相似的肿瘤细胞杀伤能力和较高的生物相容性。相较于游离DOX,DOX@PLSPL的药物血液循环半衰期延长了 2.3倍,在肿瘤病灶部位的药物富集提高了 3.1倍,并且将药物抗肿瘤能力提升了 1.75倍。此外DOX@PLSPL还表现出较高的生物安全性。（2）设计了一种靶向修饰的纳米输递体系包载抗原Tau多肽用于AD的免疫治疗（MPEG-Chol-MPLA-P）。该体系能够高效靶向抗原提呈细胞,有效刺激抗原提呈细胞成熟,激活免疫反应。MPEG-Chol-MPLA-P为水力学粒径约117nm的纳米颗粒。体系具有较高的抗原包载率（70.8%）和良好的抗原保护性。通过膜融合方式,体系显着提高了抗原的入胞效率（是游离抗原的3.2倍）。MPEG-Chol-MPLA-P能够有效刺激细胞成熟（CD40阳性表达提高了 3.7倍,MHCⅡ表达提高了 1.4倍）,激活免疫反应。相较于游离抗原,MPEG-Chol-MPLA-P能够有效地诱导抗原提呈细胞迁移进入淋巴结,提高抗原在淋巴结的富集水平（是游离抗原的2.7倍）。此外,体系显着改善了 AD行为学水平:AD鼠体系治疗组的Morris水迷宫穿台次数提升4倍,目标象限停留时间比例提升2倍。同时,MPEG-Chol-MPLA-P明显修复了 AD神经元损伤。（3）设计了一种具有ROS-酯酶双响应性的可示踪纳米杂化复合物负载基因-化学联合药物用于PD的协同治疗（GC-TRIO）。该纳米颗粒能够显着改善药物在脑部病灶的富集水平,并且具有在病灶部位可控释药的能力。GC-TRIO为水力学粒径约32 nm、形貌较均一的球形纳米颗粒。体系具有良好的稳定性,siRNA负载能力和MRI灵敏性（弛豫率为对照组的2.1倍）。同时,体系表现出较好的血脑屏障跨越能力（神经元靶向效率提高1.6倍）,明显提高了药物在胞内的内涵体逃逸能力和响应性释药能力,有效提升了病灶细胞的治疗效果（病灶细胞ROS水平下降15倍,线粒体功能恢复8.6倍,α-syn含量下降8.7倍）。此外,GC-TRIO在PD鼠表现出明显的脑部病灶药物富集作用和磁共振示踪能力。综上所述,论文根据GBM、AD和PD的治疗瓶颈问题,分别提出了相应的治疗策略,并且通过纳米输递体系将所包载的药物/抗原有效输送至目标部位,显着提高了靶点细胞的有效药物/抗原浓度,明显改善了疾病治疗的效果,为今后脑部疾病的治疗提供了新的可能。
朱立猛[4]（2021）在《壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探》文中进行了进一步梳理阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种起病隐匿的进行性发展的中枢神经系统退行性疾病,临床表现主要为认知和记忆障碍。从被发现至今,人们对AD的相关研究已经取得了巨大的进展,众多研究数据表明,AD的发病可能由多种因素共同参与,导致其病程漫长,病理机制十分复杂,且尚未有根治的方法。现有药物主要是缓解症状,不能阻止或者逆转疾病的发展。由于病理机制不明确,导致传统的治疗策略很难有效控制或治愈包括AD在内的多种复杂疾病。近年来,AD的治疗策略也逐渐发生变化,从单一治疗策略到多环节整体观的治疗策略。相对于单一的治疗策略,多环节整体观的治疗可针对疾病的不同生理环节发挥作用并且具有不良反应少、疗效显着等优点。天然产物及其衍生物由于生物利用度高、毒副作用小且大多具有多功能的特性而备受关注。因此,将具有良好生物活性的天然产物用于AD相关的治疗或许可以成为一种有效可行的策略。壳寡糖（Chitosan oligosaccharide,COS）是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖,具有多种生物活性,在生物医药和功能食品领域表现出了良好的应用前景,且COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用。本论文通过细胞和动物实验,评价了 COS对于AD的改善作用,并探究了其相关作用机制,为合理地将COS用于AD的治疗提供一定理论依据。论文具体开展的工作如下:1)COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用,然而相关的研究存在许多不足。绝大多数的研究仅利用体外细胞模型进行相关实验验证,但是关于COS是否可以穿透血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）进入大脑发挥其神经保护作用依然是个未知数。针对该问题,本研究构建了两种由单层微血管内皮细胞组成的体外BBB模型:静态Transwell模型和动态微流控芯片模型,并利用以上两种模型探究了 COS能否透过单层微血管内皮细胞构成的BBB。初步证明COS具有良好的BBB透过性,且葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporterl,GLUT-1）是其通过BBB的转运载体之一。此外,利用荧光标记与活体成像联用的技术,在活体动物上验证了 COS可以透过BBB进入大脑。2)β淀粉样蛋白（Amyloid β-protein,Aβ）自聚集生成富含β-sheet结构的有序聚集体,是导致AD的罪魁祸首。因此,通过影响Aβ的聚集来降低Aβ诱导产生的神经毒性可能是治疗AD的一种有效途径。本研究发现COS可以通过影响Aβ42的聚集来降低其诱导产生的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的释放。其作用机制为:COS能够通过静电作用和疏水相互作用结合在Aβ42寡聚体上,结合后会进一步破坏β-sheet结构,并使其转变为β-turn和Coil结构。该变化会扰乱Aβ42自身所具有的分子内结合作用,破坏Aβ42寡聚体的固有结构,使其稳定性降低,进而促进已经聚集的Aβ42纤维体解聚。除此之外,COS的结合占据了 Aβ42聚集体表面的某些特定位点,导致Aβ42聚集过程中无法向正常方向延长,从而有效地抑制Aβ42的聚集。以上作用能够显着降低Aβ42诱导产生的神经毒性。此外,COS的该作用与其剂量、聚合度和脱乙酰度成正比,-NH2基团在二者相互作用的过程中发挥了重要的作用。3)肠道菌群在AD的发生和发展有中发挥着重要的作用。通过个性化益生元干预来调节肠道微生物群可能成为治疗AD的新方法。本研究通过动物实验,探究了 COS能否通过调节肠道菌群和其代谢产物改善AD相关病理症状。结果表明,COS可以显着改善AD小鼠的认知和记忆功能损伤,降低Aβ引起的神经元凋亡和突触功能障碍。此外,COS治疗还可以重塑紊乱的肠道菌群,改善失衡的菌群代谢,修复受损的肠屏障,减轻外周慢性炎症。通过伪无菌小鼠和粪便菌群移植实验,我们发现COS或可以通过多种途径,整体协同改善AD小鼠的认知功能障碍。综上所述,本研究为将COS用于AD的治疗提供了一定的理论基础。
吴子健[5]（2021）在《通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究》文中指出目的 本次研究结合急性脊髓损伤（acute spinal cord injury,ASCI）的研究现状和热点,基于导师的临床经验,以通过抑制水通道蛋白4（aquaporin 4,AQP4）的表达从而减轻ASCI后脊髓水肿为切入点,旨在探讨通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减治疗ASCI的可能作用机制,以期为推广通腑逐瘀法治疗ASCI提供理论依据。方法 第一部分:10周龄SD大鼠30只,按随机数字表法随机分为假手术组（A组）、自制打击器2cm组（B1组）、自制打击器4cm组（B2组）、NYU组1.25cm组（C1组）、NYU组2.5cm组（C2组）,每组各6只。除Sham组外,其余各组采用改良Allen’s法造模。B1、B2组将9g打击杆分别从2cm、4cm处自由坠落撞击T10脊髓,C1、C2组使用NYU打击器分别从1.25cm、2.5cm处撞击T10脊髓。各组造模完成后分别于1、3、5、7d进行BBB评分和Reuter评分,7d后行灌注取材,石蜡包埋切片,尼氏染色,观察各组组织受损程度和神经元存活率。第二部分:10周龄SD大鼠60只按随机分配方法随机分为假手术组（Sham）、模型组（Model）、抵当汤组（DDD）、TGN-020组（TGN-020）和抵当汤联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,每组各12只。Sham组仅打开椎板暴露脊髓但不损伤脊髓;其余各组均采用自制脊髓打击器从40mm高度对脊髓进行打击。Sham组和Model组术后不予任何治疗措施干预,DDD组于术后3d予以抵当汤加减每日灌胃,持续3d,根据大鼠与人用药剂量体表面积换算法,DDD组大鼠每日用药剂量为5.04g/kg,采用蒸馏水进行稀释一定比例配制后予以灌胃处理,每日早晚各1次。TGN-020组处理方法:腹腔注射给药,每日用药剂量为5mg/kg,给药时间为3d。DDD+TGN-020组处理方法:予TGN-020腹腔注射给药,随后给予DDD灌胃处理。干预结束后进行行为学评价（BBB评分、斜板实验及Reuter评分）观察大鼠神经功能恢复情况,取材后进行脊髓组织大体观察和含水率检测、HE染色观察组织受损程度,尼氏染色观察神经元形态,免疫荧光检测各组脊髓组织AQP4、GFAP共表达的阳性细胞个数,Western Blot法检测各组脊髓组织中AQP4、GFAP、CSPG、PCNA、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,q PCR法检测各组脊髓组织中CSPG、PCNA基因的表达量,电镜下观察各组髓鞘和神经元组织形态,高尔基染色观察树突和树突棘形态。第三部分:8周龄SD大鼠40只随机分为空白血清组和含药血清组,含药血清组给予5.04g/kg DDD灌胃,持续3d,空白血清组予等剂量超纯水灌胃,持续3d,干预结束后提取血清备用。每次取胚胎大鼠8-12只,通过机械-酶消化法提取星形胶质细胞（Astrocytes,AS）,细胞采用10%的高糖培养基培养,观察细胞传代至第3代进行后续实验。首先,免疫荧光鉴定细胞中GFAP含量,随后进行实验分组:空白组（Control group,CG）、模型组（Model group,MG）、空白血清组（Blank serum group,BSG）、DDD含药血清组（DDD）、TGN-020干预组（TGN-020）、DDD联合TGN-020组（DDD+TGN-020）,除MG外,其余各组均以划痕法进行造模,造模完成后DDD予以含药血清干预,BSG予以等剂量空白血清干预,TGN-020予以100nm TGN-020干预,DDD+TGN-020先予TGN-020干预后再予DDD干预。MTT法检测DDD含药血清干预AS的安全干预浓度、最佳干预时间和干预浓度,MTT法检测各组对RAS活性的影响,免疫荧光染色法检测RAS中AQP4和GFAP共表达的细胞数,Western Blot法检测各组RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白的表达量,镜下观察DDD含药血清对RAS迁移率的影响。统计学方法:实验所得数据均使用SPSS21.0软件进行统计学处理,计量资料以均值±标准误（`X±S）表示,所得数据均经过正态性分布检测,若符合正态分布,则采用单因素方差分析,方差齐则采用LSD法,方差不齐则采用Games-Howell法;若不符合正态分布,则采用非参检验。以P<0.05提示差异具有统计学意义。结果 第一部分:自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究1.各组脊髓外观形态比较A组T10节段处硬脊膜完整,脊髓组织呈均匀乳白色,形态饱满圆润;B1、B2、C1、C2组T10节段处硬脊膜均完整,颜色呈不同程度的鲜红色或暗红色,损伤处可见水肿、瘀血及瘢痕组织增生,相对于B1、C1组,B2、C2组水肿更严重、瘀血范围更广、颜色更深、瘢痕组织更多。2.行为学评分比较BBB评分结果显示,A组术后除因手术致运动量减少外,未出现双下肢功能异常的表现,评分为21分;其余各组均出现不同程度的运动功能障碍,具体表现为:B2与B1、C2与C1相比,BBB评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）;B1与C1、B2与C2相比,BBB评分无显着差异（P>0.05）。Reuter评分结果显示,A组术后未发现感觉功能异常现象;其余各组术后均出现不同程度的感觉功能异常现象,具体表现为B2、C2组术后1d牵张反射消失,肌力、肌张力减弱或消失,疼痛回缩反射迟钝,背部感觉存在或消失;B1、C1组术后1d除肌力消失外,牵张反射、肌张力、疼痛回缩反射、背部感觉均存在,术后3d肌力开始恢复。B2与B1、C2与C1相比,Reuter评分显着降低,差异具统计学意义（P<0.05）。B1与C1、B2与C2相比,Reuter评分无显着差异（P>0.05）。3.尼氏染色尼氏染色结果显示,A组脊髓组织结构完整,灰白质边界清晰,神经元细胞形态规则、胞核大、核仁清晰可见、数量多,胞质内可见斑块样尼氏体。相比A组,其余各组结构破坏更严重,灰白质结构不清,组织空白间隙更大,损伤处可见细胞呈空泡样改变或细胞皱缩、体积减小,神经元数量减少,尼氏体模糊或消失。4.脊髓受损面积比结果表明,A组未见受损区域,比值为0,其余各组均高于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2损伤面积比值明显升高,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2损伤面积比值差异不具有统计意义（P>0.05）。5.各组脊髓前、后角神经元损伤程度比较通过分析前、后角神经元阳性细胞数结果显示,A组神经元数目多,尼氏体含量多,其余各组均少于A组,差异具有统计意义（P<0.05）;相对于B1和C1,B2和C2神经元阳性细胞数明显减少,差异具有统计意义（P<0.05）;B1与B2、C1与C2神经元阳性细胞数差异不具有统计意义（P>0.05）。第二部分:抵当汤加减调节AQP4表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究1.各组脊髓组织的大体观察从大体观察上来看,Sham组脊髓组织颜色鲜白,组织完整,未见瘀血部位和水肿;Model组在打击损伤部位可见明显的瘀血区域,瘀血颜色深红,瘀血范围较大,并可见明显脊髓水肿;DDD组在打击损伤部位可见较小的瘀血区域,瘀血部位颜色淡红,可见轻度水肿;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组大体观察相似,肉眼见无显着差异。2.各组脊髓组织含水率与Sham组相比,其余各组脊髓组织含水率均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓组织含水率均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较,脊髓组织含水率没有显着差异（P>0.05）。3.行为学观察结果各组大鼠BBB评分、斜板实验结果以及Reuter评分显示,与Sham组相比,其余各组BBB评分和斜板实验得分均显着降低（P<0.05）,Reuter评分均显着升高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组BBB评分均显着升高（P<0.05）,Reuter评分均显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。4.HE染色Sham组组织结构完整,神经元等细胞形态结构良好,未见瘢痕组织或空洞形成,未见瘀血区域或炎性物质渗出。Model组损伤部位可见组织结构离乱,大量瘢痕组织和脊髓空洞的形成,可见明显的瘀血区域,并伴有大量的炎性细胞浸润,神经元等细胞皱缩,数量减少。其余三组可见组织形态结构较完整,可见少量脊髓空洞的形成,瘀血区域范围较小,炎性细胞清润较少,神经元等细胞形态结构较完整。使用Image J软件对各组空洞面积进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组脊髓空洞面积显着增加（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓空洞面积显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓空洞面积组间比较不具有显着差异（P>0.05）。5.尼氏染色观察各组神经元形态Sham组脊髓形态结构完整,灰质呈蝴蝶状,灰白质界限清晰,可见较多的神经元分布,神经元胞质内可见染色清晰的斑块状尼氏体,神经元胞体饱满,细胞核大,核仁明显。Model组脊髓组织破坏严重,结构不完整,灰、白质界限不清,可见大量的炎性细胞浸润,神经元皱缩、液化、坏死,形成较多的空泡,尼氏体较小或消失。相对Model组,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组脊髓结构较完整,隐约可见灰白质界限,神经元仍可见,数量较多,空泡样改变减少,尼氏体数量较多、较饱满。但相对于Sham组,神经元仍存在固缩,胞浆减少,核变小,尼氏体减少等病理改变。6.免疫荧光检测各组AQP4、GFAP的阳性细胞表达量AQP4阳性细胞表达呈绿色,GFAP阳性细胞表达呈红色,DAPI染色呈深蓝色,AQP4+/GFAP+细胞表达呈黄色树枝状,各组染色背景干净,表达清晰,细胞核数量无显着差异（P>0.05）,具有可比性。Sham组少见或未见明显的AQP4+/GFAP+细胞,Model组可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,且细胞亮度高,胞体肿胀程度严重。与模型组相比,DDD组、TGN-020组以及DDD+TGN-020组细胞数量较少,亮度较低,细胞肿胀程度减轻。对各组的AQP4+/GFAP+细胞进行计数和统计,与Sham组相比,其余各组AQP4与GFAP的阳性细胞占比均显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4与GFAP的阳性细胞占比显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组间相比较,AQP4与GFAP的阳性细胞占比无显着差异（P>0.05）。7.Western Blot法检测各组AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43的蛋白表达量各组蛋白条带背景清晰,无杂带现象,蛋白表达量趋势明显,具有可比性。与Sham组相比,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG蛋白的灰度值显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值显着增高（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中AQP4、GFAP、PCNA、CSPG、NGF、BDNF、GAP-43蛋白的灰度值差异不具有统计学意义（P>0.05）。8.各组脊髓组织中PCNA和CSPG基因表达量各组基因检测的扩增曲线变化平稳,溶解曲线为平滑的单峰形态,说明引物设计好,模板未见污染,实验结果具有可比性。各组目的基因相对表达量结果显示,与Sham组相比,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着增高（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量显着降低（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较结果显示,各组脊髓组织中PCNA、CSPG基因的表达量差异不具有统计学意义（P>0.05）。9.透射电子显微镜观察髓鞘和神经元组织形态Sham组脊髓组织在透射电镜下可见髓鞘外形规则,厚薄均一,形似同心圆状,结构完整,未见破裂、缺失等改变,板层结构均匀致密,胞内线粒体丰富,胞浆饱满,清晰可见。Model组髓鞘结构不规则,部分髓鞘断裂缺失,厚薄不一,局部可见褶皱卷曲,板层结构松散、融合,线粒体肿胀,甚至部分溶解消失;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见髓鞘结构较完整,形态部分不规则但较Model组改善,部分髓鞘可见卷曲、厚薄不一,板层结构较均匀,虽有部分缺失,但松散程度相对Model组较轻,仍可见清晰的线粒体,但数量较Sham组少,胞体较小。10.电镜观察树突和树突棘形态各组脊髓经高尔基染色后结果显示:Sham组脊髓树突结构完整、形态规则、长度较长,树突上密布树突棘,树突棘分布整齐、均匀致密、数量较多;Model组脊髓树突形态不规则,部分断裂缺失,长度较短,较为纤细,树突棘数量少,稀疏分布,排列紊乱;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组脊髓树突形态有所改善、树突较长、结构较完整、周经较粗,树突棘数量较多,排列更为规则、整齐。对各组脊髓树突长度及树突棘进行定量分析,结果显示,与Sham组相比,Model组树突长度明显降低（P<0.05）,树突棘数量明显减少（P<0.05）;与Model组相比,DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组树突长度明显增加（P<0.05）,树突棘数量显着增多（P<0.05）;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组组间相比,差异不具有统计学意义（P>0.05）。第三部分:抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用1.原代AS镜下观察原代细胞培养2d,镜下可见AS细胞呈不规则形状散在分布,部分细胞形似星形,细胞核大、呈椭圆形,细胞胞浆丰富,从胞体向四周发出长而有分支的突起;将原代细胞传代至第三代可见细胞生长状态良好,适宜进行后续实验。2.AS鉴定免疫荧光染色结果显示,GFAP染色呈阳性,阴性对照组未见任何阳性染色,提示GFAP呈特异性表达,所提取的细胞为AS。3.DDD含药血清对AS的安全干预浓度,以及干预RAS的最佳干预时间和最佳干预浓度DDD含药血清干预AS的安全浓度范围为:0-15%,DDD含药血清干预RAS最佳的干预浓度为10%,最佳干预时间为48h。4.DDD含药血清对RAS活性的影响MTT结果显示,与CG组相比,其余各组RAS活性均降低（P<0.05）;与MG相比,BSG组RAS活性无显着差异（P>0.05）,DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组RAS活性均显着下降（P<0.05）;DDD、TGN-020和DDD+TGN-020组间比较无显着差异（P>0.05）。5.DDD含药血清对RAS迁移率的影响损伤24h后,各组RAS与对侧细胞完全分离,中间形成一条空白的划痕区域,划痕区未见或少见RAS;48h后部分细胞开始向对侧延伸突触,划痕区域出现部分肥大的RAS,细胞胞浆丰富,胞体呈球形,发亮,细胞加速分裂;72h后划痕区域缩小,部分RAS与对侧RAS突触交织,划痕开始愈合。在整个愈合过程中,24h各组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）;自48h开始,与MG组相比,BSG划痕区域面积比无显着差异,其余各组均明显较大（P<0.05）。DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组组间比较无显着差异（P>0.05）。72h后,MG组与BSG组划痕区域面积比无显着差异（P>0.05）。与MG组相比,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组划痕区域面积比明显较大（P<0.05）,组间比较无显着差异（P>0.05）。以上划痕区域面积比的改变反映了RAS在损伤发生后向受损区域的迁移速率。6.各组对RAS中AQP4、GFAP荧光表达量的影响使用免疫荧光染色法对RAS中AQP4、GFAP和细胞核进行了标记。染色结果显示,AQP4+细胞呈绿色,GFAP+细胞呈红色,细胞核呈蓝色,荧光双标的细胞呈黄色的不规则树枝状。其中,CG组仅见12个零星分布的AQP4+/GFAP+细胞;MG组和BSG可见较多的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较高,细胞肿胀程度严重;DDD组、TGN-020组、DDD+TGN-020组可见较少的AQP4+/GFAP+细胞,亮度较低,细胞肿胀程度较轻。对AQP4+/GFAP+细胞进行计数统计,结果表明,与CG相比,其他各组阳性细胞占比显着增多（P<0.05）;与MG相比,除BSG组无显着差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比显着减少（P<0.05）;DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组阳性细胞占比组间相比无显着差异（P>0.05）。7.各组对RAS中AQP4、GFAP和NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量的影响结果显示,与CG组相比,其余各组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着降低（P<0.05）;与MG组相比,除BSG组无明显差异外（P>0.05）,DDD组、TGN-020组和DDD+TGN-020组AQP4和GFAP蛋白表达量均显着降低（P<0.05）,NGF、BDNF、GAP-43蛋白表达量均显着增高（P<0.05）,3组组间比较无显着差异（P>0.05）。结论 1.自制简易脊髓打击器从20mm、40mm高处垂直撞击脊髓组织具有和NYU打击器从12.5mm、25mm处打击脊髓损伤程度相似的脊髓损伤动物模型,自制简易脊髓打击器安全性高,稳定性好,操作简便,价格低廉,可供科研工作者参考。2.通腑逐瘀法治则指导下抵当汤加减可有效消除SCI大鼠损伤处水肿,促进神经功能康复。其具体的作用机制为:通过抑制AQP4的表达可抑制反应性星形胶质细胞活化,减少胶质瘢痕形成,提高神经营养因子、神经生长因子及细胞膜生长相关蛋白的表达,促进神经功能康复。3.DDD含药血清能通过抑制AQP4的表达,有效减轻RAS水肿,减少RAS活化和减缓RAS迁移,促进RAS中神经营养因子的分泌。
任非非[6]（2021）在《基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响》文中认为目的:观察AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成对抑郁大鼠海马神经元突触可塑性的影响及醒脾解郁方干预效应。方法:实验研究分为四部分。第一部分:140只雄性SD大鼠随机分为空白组（CON）、模型组（MOD）、醒脾解郁方组（XPJYF）、草酸艾司西酞普兰组（EOT）、醒脾解郁方联合草酸艾司西酞普兰组（XPJYF+EOT）。每组根据应激时间各分为3w、6w组。除CON外,其余各组采用慢性束缚应激（CRS）造模,共21d。各组造模的同时给予相应药物干预。造模前及造模第3 w、6 w时进行行为学观察。造模3 w时评价脾虚程度,结合行为学实验,评价模型成功与否。取材后以HE染色和尼氏染色观察海马CA1区神经元病理变化及XPJYF干预效应。第二部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后观察海马CA1区神经元突触及线粒体超微结构;分析线粒体及神经元突触体视学指标;高尔基染色观察神经元轴树突分支变化;提取海马突触体,免疫荧光染色观察突触重塑蛋白表达;Western blot检测线粒体合成蛋白含量;检测海马线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ及线粒体酶活性。第三部分:制备XPJYF低、中、高剂量组含药血清;体外分离、培养原代海马神经元细胞并鉴定;采用CCK8法进行XPJYF细胞毒性实验;建立皮质酮（CORT）诱导海马神经元损伤模型,分为 CON、CORT、CORT+X（H）、（M）、（L）、CORT+E、CORT+E+X（H）、（M）、（L）共9组。以细胞免疫荧光观察SYN、PSD-95表达及海马神经元线粒体成像;Western blot检测线粒体生物合成及突触重塑蛋白表达;ELISA及RT-PCR检测5-HT、DA及其受体情况。第四部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后以免疫荧光三标染色观察海马CA1区NeuN/CD31/GFAP表达;RT-PCR检测海马AMPK/SIRT1/PGC-1α通路基因表达;免疫组化及 Western blot 检测 NeuN、GFAP、VEGF、Collagen Ⅳ蛋白表达。结果:1.第一部分1.1宏观表征:造模前大鼠状态良好,反应灵敏,活动自如。造模3 w后,反应降低,神态倦怠,活动减少,毛发干枯或发黄,粪便逐渐变稀,至6 w时表现更明显,各用药组较模型组有改善。1.2体质量变化:模型各组大鼠体重较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各用药组体重增加（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药3 w、联合各组体重增加（P<0.01,P<0.05）,西药6 w组降低（P<0.05）。联合各组体重较西药组增加（P<0.01,P<0.05）。1.3行为学:模型各组糖水偏好率（SPT）较空白组降低（P<0.01）,强迫游泳不动时间（FST）延长（P<0.01）。与模型组比较,西药、联合各3 w及各用药6w组SPT升高,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。联合各组SPT较中药、西药组升高（P<0.01,P<0.05）,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。与同组别基线比较,各组各时间点SPT降低（P<0.01）,模型各组及中药、西药各6 w组FST延长（P<0.01,P<0.05）。1.4血清淀粉酶、尿D-木糖排泄率比较:造模3 w后血清淀粉酶和尿D-木糖排泄率均降低（P<0.01）,至造模6周时更低（P<0.01）。1.5海马CA1区病理改变:HE染色:空白组海马CA1区神经元数量、分布、形态均无异常,圆形胞核清晰居中。模型3w组神经元数量减少,排列及形态不规则,细胞大小不一,部分呈三角形,细胞核深染、固缩,核仁显示不清;至6w时损伤进一步加重。各用药组有不同程度改善,以中药6 w组和联合组较为明显。尼氏染色:空白组海马CA1区神经元正常分布,胞质内可见丰富的尼氏小体,近胞核处呈“虎斑样”,远端呈细颗粒样,核仁清晰。模型3 w组细胞排列散乱,胞质内尼氏小体减少。至6w时,损伤加重,细胞皱缩明显,部分细胞尼氏体减少,并可见中央性染色质溶解现象。各用药组损伤逐渐恢复,以西药3 w组及中药6 w组明显。2.第二部分2.1神经元超微结构:正常组神经元突起较多,线粒体正常,突触结构完整,突触小泡较多。造模3 w后,线粒体肿胀,嵴断裂,突触小泡数量减少。至造模6 w,损伤加重,突触间隙显示不清,突触小泡减少,聚集分布,线粒体膜破坏,嵴断裂,基质空泡样变。各用药组上述损伤减轻。2.2线粒体体视学:模型各组Vvm较空白组升高（P<0.01）,NM、δ、δm降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组Vvm降低（P<0.01,P<0.05）,各6 w组NM升高（P<0.01）,中药、联合各组及西药6 w组δ、δm升高（P<0.01,P<0.05）。较中药组,西药6 w组δ、联合6 w组Vvm降低（P<0.01）,联合各组δm升高（P<0.01,P<0.05）。2.3突触体视学:模型各组数密度（Nv）、面密度（Sv）、突触小泡面数密度（NS）均较空白组降低（P<0.01）。中药、联合各6 w组Nv、Sv、Ns较模型组升高（P<0.01,P<0.05）。2.4高尔基染色:模型各组Sholl交点数及树突棘较空白组减少（P<0.01）。中药、联合各组Sholl交点数较模型组增多（P<0.01,P<0.05）,中药、西药各6 w组及联合各组树突棘密度升高（P<0.01,P<0.05）,且联合6 w组较中药、西药各6w组升高（P<0.05）。2.5突触体突触重塑蛋白:与空白组比较,模型3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01）,6w组降低（P<0.05）,各组SYN、syntaxin 1均降低（P<0.01）。与模型组比较,中药、联合各组及西药3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01,P<0.05）,中药、联合各组SYN升高（P<0.01）,中药、西药及联合各6 w组syntaxin 1升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药6 w组SYN降低（P<0.05）,联合6 w组GAP-43增加（P<0.01）。2.6线粒体生物合成蛋白:模型各组SIRT1、PGC-1α、AMPK-α1、Tfam、NRF1较空白组均降低（P<0.01）。与模型组比较,西药3 w组SIRT1和AMPK-α1、联合各组SIRT1、PGC-1α、Tfam升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合3 w组AMPK-α1、6w组PGC-1α表达升高（P<0.01）。3.第三部分3.1细胞毒性实验:经免疫荧光鉴定,培养的海马神经元符合神经元细胞特征。经CCK8实验,确定醒脾解郁方含药血清浓度为高剂量组10%、中剂量组10%和低剂量组20%,作用时间确定为24h。3.2线粒体生物合成蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组SIRT1、PGC-1α、NRF1、Tfam 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 组 SIRT1、NRF1、Tfam 升高（P<0.01）,CORT+E 组 SIRT1 降低（P<0.05）,CORT+X（H）组PGC-1α 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+X（H）组 PGC-1α、Tfam 升高（P<0.05）,CORT+E+X（M）组 NRF1、Tfam 升高（P<0.01）。3.3突触重塑蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组GAP-43、SYN、PSD-95 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 各组 GAP-43、SYN 升高（P<0.01）,CORT+X（H）组 PSD-95 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 GAP-43、SYN、PSD-95 升高（P<0.01,P<0.05）。3.4 5-HT、DA及其受体mRNA含量:与CON组比较,CORT组、CORT+E组5-HT、DA、5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X（H）组 5-HT、DA 升高（P<0.05）,CORT+E 组 5-HT 降低（P<0.05）,CORT+X 的 H、M组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01）。与 CORT1+E 组比较,CORT+E+X（H）组 5-HT 升高（P<0.05）,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01,P<0.05）。4.第四部分4.1线粒体合成基因表达:模型各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组 SIRT1 mRNA、PGC-1αmRNA、AMPK-α1 mRNA 均升高（P<0.01）,中药6w组、西药及联合各组NRF1 mRNA升高（P<0.01）,西药3 w组、中药及联合各组Tfam mRNA表达均升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA、NRF1 mRNA 均升高（P<0.01）,西药 3 w 组 SIRT1 mRNA升高（P<0.01）。4.2突触微环境蛋白表达:模型各组NeuN、GFAP、VEGF较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,中药及联合各组NeuN、GFAP、VEGF均升高（P<0.01,P<0.05）,西药各组GFAP升高（P<0.01）,西药3 w组VEGF升高（P<0.01）。与中药组比较,西药各组GFAP 降低（P<0.05）,联合各组 GFAP 升高（P<0.01）,联合 3 w 组 VEGF 升高（P<0.05）。结论:1.慢性束缚应激3周时,动物模型符合肝郁脾虚型抑郁症标准,脑内海马CA1区神经元损伤,且随应激时间延长,损伤程度加重。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可不同程度减轻神经元损伤,改善抑郁样行为,中药的远期保护优势较西药明显,且以两者联合应用作用更为显着;2.抑郁模型大鼠脑内海马CA1区神经元突触超微结构破坏,线粒体损伤,突触重塑功能降低,与AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成减少直接相关。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可动态调控该信号通路,促进海马神经元突触重塑,但二者作用的优势环节不同,西药在调节神经递质方面更具优势,而中药在改善线粒体功能方面更为明显,且中药的远期作用效果优于西药。3.抑郁症海马神经元突触微环境中星形胶质细胞、微血管内皮细胞及微血管基底膜损伤,与神经元突触重塑相关。中药醒脾解郁方可通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路增加线粒体生物合成,保护突触微环境,促进抑郁症神经重塑,作用较西药草酸艾司西酞普兰更具优势,且中西药联合应用效果显着。
彭丽佳[7]（2021）在《ZC3H12D在脑缺血-再灌注损伤中抗炎作用及机制》文中指出脑缺血-再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）是脑血管栓塞再通后引起的一种继发性损伤,CIRI会导致神经细胞发生水肿坏死、并导致患者出现严重的神经功能障碍,及时挽救神经细胞是救治脑缺血-再灌注损伤的关键。ZC3H12D（具有CCCH锌指结构域的蛋白质12d,Zinc finger CCCH domain-containing protein 12d）是CCCH型锌指蛋白家族的一员,在肿瘤、炎症反应发生发展中发挥重要作用。我们前期通过高通量二代测序技术发现,ZC3H12D基因在CIRI中差异表达,ZC3H12D可能参与CIRI的发生发展过程,其作用机制有待进一步研究。因此我们拟通过建立在体和离体脑缺血-再灌注损伤模型,采用免疫荧光共染、qRT-PCR、Western Blotting、ELISA等生物技术方法,从现象、功能、机制不同层面对ZC3H12D参与CIRI中的抗炎作用进行研究,为脑缺血-再灌注损伤的临床治疗提供一定的理论基础。第一部分脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织中ZC3H12D和P65蛋白的表达变化[目的]观察MCAO/R（大脑中动脉闭塞/再灌注模型,Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion）损伤后的大鼠皮质神经元的形态变化,检测梗死区及脑组织中ZC3H12D和P65基因的表达变化趋势。[方法]1.建立脑缺血-再灌注损伤损伤模型:将30只雄性SD大鼠随机分为3组:对照组（control组）、假手术组（sham组）、脑缺血-再灌注损伤组（MCAO/R组）,用Zea-longa线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,并用Zea-Longa分级评分筛选造模成功的大鼠。2.MCAO 2h/R 24h后取材,用TTC进行染色,然后观察脑组织的梗死情况。3.尼氏染色（硫堇）染色观察神经元内尼氏体数量变化。免疫荧光检测神经元凋亡及ZC3H12D表达定位的细胞类型。4.观察MCAO/R后大脑皮质ZC3H12D及P65表达变化情况。Western Blotting检测ZC3H12D及P65蛋白的相对表达量。[结果]1.大鼠MCAO/R脑缺血-再灌注损伤造模成功。MCAO/R后TTC染色可观察到右侧大脑出现明确的白色梗死灶。2.免疫荧光双标染色发现ZC3H12D与大脑皮质神经元共染。3.MCAO/R后大脑皮质神经元尼氏体减少（P=0.0022）,凋亡细胞数明显上升（P<0.0001）。4.MCAO/R大脑皮质ZC3H12D及P65表达水平明显上升（P<0.05）。[结论]1.ZC3H12D在大脑皮质神经元细胞表达。2.大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型造模后大脑皮质神经元数目明显减少,凋亡细胞数明显上升。3.大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型造模后使大脑皮质ZC3H12D及P65表达增加。第二部分ZC3H12D对氧糖缺失/复氧损伤PC12细胞炎症反应和细胞凋亡的影响[目的]探讨ZC3H12D对OGD/R（氧糖剥夺/复氧复糖模型,oxygen glucose deprivation/reoxygenation）损伤PC12细胞炎症反应和细胞凋亡的影响。[方法]1.确定OGD/R缺氧/复氧时长。通过细胞形态学观察、细胞计数、qRT-PCR检测ZC3H12D mRNA的表达确定最佳复氧时间点。2.检测慢病毒转染m/sh-ZC3H12D的效率。通过免疫荧光及Western Blotting检测转染后ZC3H12D基因的蛋白表达量判断转染是否成功。3.检测过表达ZC3H12D后细胞活力。CCK8法检测过表达ZC3H12D后细胞活力。4.检测过表达ZC3H12D对P65核蛋白的影响。通过Western Blotting检测各组ZC3H12D蛋白表达水平。5.检测过表达ZC3H12D对炎症因子的影响。通过qRT-PCR及ELISA检测炎症因子的mRNA及分子的表达水平。6.检测过表达ZC3H12D对细胞凋亡及凋亡蛋白的影响。通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并通过Western Blotting检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达量。[结果]1.与Control组相较,OGD/R复氧时间3h ZC3H12D mRNA比6h表达水平差异更明显;2.CCK8检测发现慢病毒转染过表达ZC3H12D后细胞活力增加（P=0.0003）;3.过表达ZC3H12D可以降低细胞中核蛋白P65的表达量,降低炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和 NF-κB 的表达;4.过表达ZC3H12D可以降低细胞凋亡率并增加抗凋亡蛋白Bcl-2并降低凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达量。[结论]1.过表达ZC3H12D可能通过抑制NF-κ B信号通路降低炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达,从而在氧糖剥夺/复氧复糖损伤中保护细胞;2.过表达ZC3H12D可以降低氧糖剥夺/复氧复糖模型造模后细胞凋亡率,并增加抗凋亡蛋白、抑制凋亡白蛋白的表达,说明ZC3H12D也可以通过抗凋亡的作用保护细胞。第三部分ZC3H12D通过调控NF-κB信号通路和降低炎症因子mRNA稳定性在脑缺血-再灌注损伤中发挥抗炎作用[目的]观察TNF-α刺激NF-κB信号通路对炎症因子表达的影响。观察干扰ZC3H12D对炎症因子mRNA稳定性的影响。[方法]1.TNF-α激活NF-κB信号通路后观察P65核蛋白的活化情况及入核情况:通过Western Blotting检测加入TNF-α刺激后的P65蛋白的相对量,检测NF-κB信号通路的活化情况;2.P65入核情况:通过免疫荧光检测P65和细胞核共染,进行荧光检测确定各组P65核蛋白入核情况并做对比;3.观察TNF-。激活NF-κ B信号通路后对炎症因子表达的影响:通过qRT-PCR 及 ELISA 分析各组炎症因子 IL-1 β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB的变化情况;4.观察过表达ZC3H12D及抑制ZC3H12D表达对炎症因子mRNA稳定性的影响:通过qRT-PCR检测0h、1h、3h、6h各组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB 的 mRNA 水平。[结果]1.TNF-α激活NF-κB信号通路,并使P65核蛋白表达水平升高,过表达ZC3H12D可部分逆转TNF-α的作用（P<0.05）;2.TNF-α可以使进入细胞核的P65增多,过表达ZC3H12D可以减少入核（P<0.05）;3.与TNF-α+过表达ZC3H12D组相较,过表达ZC3H12D组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-K B mRNA水平及蛋白水平均降低（P<0.05）;4.与干扰ZC3H12D组相较,过表达ZC3H12D随着时间逐渐明显降低炎症因子 IL-1 β、IL-6、TNF-α 和 NF-κ B mRNA 的表达水平（P<0.05）。[结论]1.过表达ZC3H12D可通过抑制NF-κ B信号通路活化降低炎症因子的表达;2.过表达ZC3H12D可通过降低炎症因子mRNA的稳定性抑制炎症反应。
闵颖俊[8]（2021）在《新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究》文中研究表明[目的]缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是新生儿致死致残的首要原因,30%的幸存患儿会遗留神经系统后遗症,但发病机制不清。突触是信息传递的核心,突触损伤为HIBD患儿行为异常的关键机制。髓系细胞是指由髓系前阶段幼稚细胞分化的所有髓细胞,在广义上包括粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞以及单核系细胞,在脑内主要为小胶质细胞（MGs）及外周入侵的单核细胞（MDMs）。由髓系细胞活跃带来的神经炎症是HIBD发生的核心机制之一。吞噬和炎症是髓系细胞（MGs及MDMs）的主要功能,并籍此调控突触可塑性。生理情况下,发育脑内吞噬与炎症维持在一定的水平,“吞噬-炎症”平衡将帮助形成稳定的神经环路。病理情况下,“吞噬”和/或“炎症”功能失去原有稳态,出现激活或抑制,不再保有平衡状态,此为“吞噬-炎症”失衡。除了吞噬和炎症功能,目前的研究认为MGs和MDMs作为脑内最重要的免疫细胞,生理情况下可通过吞噬及炎症功能参与调控突触修剪,从而参与神经环路形成;病理情况下,它启动脑内炎症反应,还可通过吞噬作用对微环境稳态的损伤及修复发挥作用。HIBD后脑内“吞噬-炎症”出现失衡,它在HIBD所致突触损伤中的发病机制,及其分子机理尤其是可能的调控还有待进一步研究。我室的前期研究证实,HIBD后除MGs活化外,MDMs亦入侵脑实质,MGs炎症及吞噬功能活跃,但二者与突触损伤修复的关系尚不清楚。据此本课题拟从髓系细胞（MGs及MDMs）在HIBD所致“吞噬-炎症”失衡的角度入手,重点研究它们在突触损伤、修复中的作用,试揭示HIBD后两种髓系细胞“吞噬-炎症”失衡在HIBD后突触损伤中的作用机制及其可能的调控。[方法]1.采用CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+双转基因小鼠及C57BL/6J小鼠通过改良的Rice-Vannucci法建立新生鼠HIBD模型,以进一步确认两种不同髓系细胞的功能。随机将动物分为假手术组（Sham）及缺氧缺血组（HI）,其中缺氧缺血组依据前期研究又进一步分为缺氧缺血轻度损伤组（HIM）、缺氧缺血重度损伤组（HIS）。2.行为学实验明确HIBD后6 w小鼠的行为学改变。3.TTC染色确认HIBD后3 d小鼠脑梗死范围。4.HE染色揭示HIBD后3 d及6 w小鼠的脑组织形态学改变。5.尼氏染色评估HIBD后3d及6 w的小鼠脑神经元损伤。6.Tunel染色评估HIBD后3 d的小鼠脑细胞的凋亡。7.FJB染色评估HIBD后1 d及3 d脑组织神经元的损伤。8.Western Blotting 检测 HIBD 后 3 d 突触相关蛋白（PSD95 及 SYP）、TREM2 的表达,以及OGD前后MGs细胞系BV2突触后膜蛋白表达的改变。9.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞在脑皮层及海马的活跃情况,及其与突触相关蛋白间的关系。10.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内CD11b+细胞LAMP1、PSD95的表达。11.利用两种髓系细胞系（MGs细胞系-BV2,单核巨噬细胞系-Raw264.7）进行吞噬刺激实验,检测两种髓系细胞在糖氧剥夺（OGD）前后吞噬能力的变化。12.磁珠分选结合的流式细胞学实验检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及CD200R的表达。13.免疫荧光技术检测HIBD后3 d脑内两种髓系细胞TREM2及其衔接子DAP12和促炎因子IL-1β、IL-6的表达。14.免疫荧光技术检测炎症因子（IL-1β、IL-6）刺激后,原代MGs分泌PSD95蛋白的情况。[结果]1.验证HIBD后脑损伤情况（1）HIBD后行为学改变a.旷场实验结果证实HIBD后6 w各组小鼠的运动功能未受到明显损害,但HIM组小鼠在旷场实验检测的10-15 min时间段以及20-25 min时间段内,其在中间区域停留时间较Sham组小鼠增加。b.黑白箱实验结果证实HIBD后6 w,HIM及HIS组小鼠在黑箱与白箱之间的穿梭次数减少。（2）HIBD后脑组织病理学异常a.HIBD后3 d,HIS组小鼠脑组织出现明显梗死灶,Sham组及HIM组均未见到明显梗死灶。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域质地疏松、染色变浅、可见噬元现象,可见局灶性巨噬细胞、MGs和少量中性粒细胞浸润,部分细胞出现典型坏死,HIM组小鼠脑组织形态学未见明显改变;HIBD后6w,HIS组海马CAI、CA2、CA3区均可见组织结构破坏、细胞数量减少、神经元丢失;HIM组小鼠海马CAI区域细胞变少,部分神经元丢失。（3）HIBD后神经元受损a.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马区域尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑内尼氏小体数量及颜色深浅未见明显改变;HIBD后6 w,HIS组小鼠海马CAI、CA2、CA3区均可见尼氏小体数量减少、染色变浅;HIM组小鼠脑组织海马CAI区域尼氏小体数量减少,染色变浅。b.HIBD后3d,HIS组小鼠脑皮层及海马CA1、CA2、CA3区域出现大量凋亡细胞,且以皮层及CA2区域最为严重,海马齿状回未见凋亡细胞。c.HIBD后1 d及3 d小鼠脑皮层及海马CA2区域有大量急性坏死的神经元。2.验证HIBD后突触受损情况（1）突触的丢失及清除:HIBD后突触丢失增多,MGs为吞噬突触的髓系细胞a.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马部位神经元标记物-NeuN的表达下降,突触素蛋白SYP的表达未见明显变化,突触后膜蛋白PSD95表达增高。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区域突触后膜蛋白PSD95表达增高并与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触后膜蛋白PSD95的表达未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达在梗死灶中心区域出现下降,在梗死灶的边缘区域均出现增高,且主要与MGs共定位;HIM组皮层及海马CA2区域突触素蛋白SYP的表达出现增加。（2）MGs表达突触蛋白a.HIBD后3 d,Sham及HIM组PSD95散在分布在MGs周围,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见PSD95。HIS组皮层及海马PSD95表达增多,MGs胞体变圆,突起缩短,胞体内存在有大量PSD95,部分可沿着胞膜分布,MDMs主要存在于梗死的中心区域,但不与PSD95接触。b.HIBD后3d,Sham及HIM组SYP呈现厚厚一层,铺在MGs胞体一端,未观察到脑实质内存在MDMs,MGs胞体较小,突起较长,分支较多,分支及胞体内部分可见SYP。HIS组皮层及海马SYP依旧是厚厚一层,但并不是铺在MGs胞体一端,而是横贯铺在MGs胞体中间,MGs胞体变圆,突起缩短,部分细胞的突起几乎不可见,胞体内存在有少量突触素蛋白SYP,MDMs主要存在于梗死灶的中心区域,但几乎不与突触素蛋白SYP接触。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马区域,CD11b+细胞内部分突触后膜蛋白PSD95与溶酶体蛋白1 LAMP 1共定位,部分未与LAMP 1共定位。d.OGD后0 h,MGs细胞系PSD95的表达明显增加,OGD后24 h恢复到OGD前水平。e.OGD后0h,原代MGs其PSD95的表达出现增多,仅炎症因子IL-6刺激后,在正常培养条件下,MGs分泌PSD95较未加炎症因子刺激组出现增多,OGD后MGs分泌PSD95蛋白的水平进一步增高,均高于炎症刺激后的正常培养组。3.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡（1）HIBD后吞噬活跃,MGs主要执行吞噬突触的功能a.HIBD后3d,HIS组皮层及海马部位TREM2表达增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马实质均可见到外周血单核细胞（MDMs）浸润。c.正常培养条件及糖氧剥夺（OGD）后,小鼠MGs细胞系-BV2的吞噬能力始终强于单核巨噬细胞系-Raw264.7;OGD后BV2细胞始终保持很强的吞噬能力,但Raw264.7细胞系的吞噬能力下降。（2）HIBD后炎症反应活跃,MGs与MDMs均表达炎症介质,但仅MDMs表达 IL-6a.HIBD后3 d,HIS组皮层梗死灶边缘区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组皮层IL-1β水平未见明显变化;HIS组海马CA2区梗死灶边缘及中心区MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平增高;HIM组海马MGs与MDMs促炎因子IL-1β水平下降。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心区MDMs促炎因子IL-6水平增高,梗死灶边缘区MDMs促炎因子IL-6水平出现下降;HIM组皮层MDMs促炎因子IL-6水平未见明显变化,但HIM组海马MDMs促炎因子IL-6水平出现下降。各组别未见MGs表达IL-6。4.HIBD后脑内“吞噬-炎症”失衡可能的调控机制a.HIBD后3 d,HIS组脑皮层内MGs表达TREM2及CD200R均增加,但MDMs上二者的表达未见明显变化;HIM组中仅MDMs表达CD200R出现增加。b.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区域梗死灶中心及边缘区MGs表达TREM2增高;HIM组皮层及海马CA2区域MGs表达TREM2未见明显变化;各组别MDMs未见TREM2表达。HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心及边缘区的MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP12增高;HIM组皮层及海马CA2区MGs、MDMs表达TREM2衔接子DAP 12未见明显变化。c.HIBD后3 d,HIS组皮层及海马CA2区梗死灶中心区PSD95、TREM2、DAP12表达出现增加,放大到600X后,可见有部分细胞可以共表达TREM2、PSD95以及DAP12,但具体细胞类型还有待进一步研究。[结论]1.HIBD后脑内神经元及突触受损,MGs为脑内执行突触吞噬的髓系细胞,可表达吞噬蛋白TREM2,TREM2可能参与调控HIBD后MGs及MDMs吞噬活动。2.MG可吞噬及分泌突触后膜蛋白PSD95,炎症因子（IL-6及IL-1β）均可刺激MGs 表达 PSD95。3.MGs与MDMs均可释放炎症因子IL-1β,但MDMs的炎症反应更强烈并主要表达IL-6,且其释放的IL-6对MGs的吞噬功能可能具有调控作用,CD200R参与调控MGs及MDMs炎症释放。
汤竣杰[9]（2021）在《p75NTR在PTSD发生中的作用与机制研究》文中认为创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder,PTSD）是指个体经历突发性、威胁性或灾难性生活事件后,延迟出现和长期持续存在的精神障碍。根据PTSD的诊断标准,PTSD发生的首要外在因素（诱因）是有创伤性事件经历,即个体所处的外在环境对PTSD的发生至关重要。特殊环境,如高原、爆炸、地震、烧伤及其他灾害环境包括海难、矿难及泥石流都会增加PTSD的发生风险。近年来随着意外创伤性事件及自然灾害的频繁发生,PTSD的发病率逐年增加,且病程长,治愈率低,已受到高度关注。PTSD不仅可导致个体生活质量下降、社会职业功能受损,而且还经常与药物滥用、抑郁、焦虑、恐惧症等共病,并且在缺少社会支持的情况下,给患者、家庭及社会造成长期持续的负面影响,带来沉重的经济负担。因此寻找治疗PTSD的有效靶点,通过靶向干预的方法治疗PTSD具有至关重要的意义。p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）是一种神经生长因子低亲和力受体,在发育中的神经系统和成年损伤或神经变性疾病者的中枢神经系统中高度表达。作为一种多效性神经营养因子受体,p75NTR通过与其他蛋白分子形成多聚体信号复合物发挥不同的生物学功能。p75NTR可作为神经营养蛋白家族成员如神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）的受体在神经元存活及神经再生中起作用。p75NTR还可作为Nogo-66受体（Nogo-66 receptor,Ng R）的协同受体参与神经元突起生长的抑制效应。此外,p75NTR也是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）受体超家族中第一个具有细胞内死亡结构域的成员,参与神经元的凋亡、自噬过程的调控。在中枢神经系统,p75NTR对神经再生的影响及对神经元凋亡的调控均影响树突棘的形态密度,进而影响突触可塑性。因此p75NTR具有多种生物学功能,主要包括促进神经元存活、介导细胞凋亡、参与突触可塑性改变过程、诱发自噬等。有证据表明p75NTR可能通过凋亡、自噬调控海马神经元突触可塑性,而海马突触可塑性改变会导致一系列行为认知障碍,且已证实与抑郁、自杀倾向等PTSD共症的发生有关。提示p75NTR可能参与PTSD发生,可作为治疗PTSD的潜在治疗靶点。为探讨p75NTR在PTSD发病过程中的作用与机制,本实验分别利用p75NTR基因敲除小鼠及p75NTR过表达AAV病毒感染小鼠,采用单一连续刺激（single-prolonged stress,SPS）法制备PTSD小鼠模型,通过旷场实验、高架十字迷宫及水迷宫行为学方法检测p75NTR对PTSD小鼠的行为学影响,并通过HE、尼氏、高尔基染色探讨其病理机制,在此基础上进一步通过免疫荧光、Western blot等技术探讨p75NTR在PTSD发病过程中的分子机制。主要研究内容:1.p75NTR基因敲除/过表达小鼠的获得与鉴定选取p75NTR基因敲除杂合子小鼠交配,得到纯合子敲除p75NTR后代,采用多重PCR技术进行基因型鉴定,并通过检测p75NTR的表达进一步加以验证;将p75NTR过表达腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）通过侧脑室注射正常小鼠获得p75NTR过表达小鼠,采用免疫荧光、Western blot技术检测p75NTR及病毒标签蛋白HA的表达情况对获得的p75NTR过表达小鼠进行鉴定。2.不同表达水平的p75NTR对PTSD小鼠的行为学影响分别对p75NTR基因敲除/过表达动物使用国际通用的SPS法制备PTSD小鼠模型,度过两周应激期后通过旷场实验、高架十字迷宫及水迷宫行为学方法检测p75NTR对PTSD小鼠的行为学影响。3.p75NTR在PTSD发病过程中的病理机制分别通过HE、尼氏染色检测海马神经元的数量和形态,并采用高尔基染色法检测树突棘的密度和形态,探讨p75NTR在PTSD发病中的组织病理机制。4.p75NTR在PTSD发生中的分子机制分别应用TUNEL染色、免疫荧光、Western blot等实验方法对p75NTR参与PTSD的分子机制进行探讨。首先通过免疫荧光、Western blot技术检测Beclin-1、LC3A/B等自噬相关基因在海马区的表达情况,探讨p75NTR在PTSD诱导自噬中的作用;其次使用TUNEL染色法检测实验动物海马区凋亡情况,同时检测神经元特异性标记物Neu N和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,探讨p75NTR对实验动物海马区神经元凋亡的影响;最后使用突触标记物Synapsin I、PSD95检测p75NTR在PTSD小鼠海马神经元突触可塑性中的调控作用。主要结果及结论:1.获得p75NTR基因敲除/过表达实验动物,使用SPS法制备了PTSD小鼠模型。2.行为学检测结果表明p75NTR敲除/过表达均能有效改善SPS法刺激下的PTSD小鼠症状。3.组织病理染色结果发现p75NTR在SPS法刺激下的PTSD小鼠模型中,参与介导海马区神经元凋亡与突触可塑性改变的调控,影响树突棘密度和轴突长度,可能是p75NTR参与PTSD发生过程中的组织病理机制。4.p75NTR参与PTSD发生的分子机制可能是通过调控海马神经元自噬、凋亡、突触可塑性相关分子的表达参与PTSD的发生。
王立平[10]（2021）在《氯化镧对子代大鼠海马树突棘可塑性及RAS和RAP相关蛋白的影响》文中提出目的:近年来,随着科学技术的发展,稀土元素（Rare earth elements,REEs）得到了更为充分的开发利用。我国的稀土含量位居世界首位,在开发利用的同时越来越多的REEs通过生物链进入人体。我国已有流行病学报道,REEs对儿童智力发育产生的伤害无法治愈,对学习记忆等认知能力也会产生负面影响。REEs对人类健康造成的影响已经成为重要的公共卫生问题。镧（Lanthanum,La）是REEs中的代表,化学性质较为活泼,并可以在脑内蓄积,对中枢神经系统产生不可逆的损害。树突棘作为神经元的重要组成部分,树突棘数量及形态对神经元发育和脑认知功能（包括学习和记忆能力）发挥着重要的作用。本研究通过动物体内实验,采用神经行为学、病理学、分子生物学、免疫荧光等实验技术,从La对海马RAS和RAP相关蛋白表达的影响进而导致树突棘数量及形态变化的角度,探讨研究La导致子代大鼠学习记忆能力低下的机制。研究方法:从中国医科大学实验动物中心购买48只成年清洁级、体重在250±10 g的Wistar大鼠,雌雄各24只。于动物室适宜的饲养环境下饲养一周后随机分为对、低、中、高四个组,按照雌雄比例1:1进行同笼交配,确定成功受孕后分别给予LaCl3浓度为0%、0.125%、0.25%、0.5%的蒸馏水溶液作为饮用水。孕哺期染毒结束后,对仔鼠（21d）进行各项指标的检测。水迷宫检测仔鼠的学习记忆能力;尼氏染色法观察海马神经元中尼氏体的表达情况;高尔基染色方法观察海马神经元树突棘密度及形态的异常变化;免疫荧光双标法检测海马SNK-SPAR,SNK-PSD95及SPAR-PSD95表达及共定位的情况;RT q PCR检测海马Ras及其上游Rasgrf1、Rapgef2、Spar、Snk和Psd95 mRNA转录水平;Western blot技术检测RAS、RAP及其上游SNK、SPAR、PSD95、RASGRF1、SPAR和RAPGEF2,下游ERK和p-ERK蛋白表达水平。使用SPSS 19.0软件对上述结果进行统计分析。结果:1.LaCl3对仔鼠的学习和记忆能力的影响。Morris水迷宫实验的定位航行试验结果表明,随着LaCl3暴露剂量的增加,各组仔鼠找到水下平台的逃避潜伏期和游泳距离逐渐增加。在空间探索实验中,仔鼠在目标象限累积停留时间和仔鼠穿越目标象限的次数均随着LaCl3暴露剂量的增加而减少。2.LaCl3对仔鼠海马神经元中尼氏体表达水平的影响。对照组仔鼠海马神经元中CA1、CA3、DG区的尼氏体清晰可见,表达较强。随着LaCl3暴露剂量的增加,各剂量组仔鼠海马神经元中的尼氏体表达逐渐减弱。3.LaCl3对仔鼠海马神经元树突棘密度及形态的影响。随着染La剂量的增加,各剂量组仔鼠海马神经元树突棘的总密度逐渐降低,且mushroom,stubby型树突棘数量明显减少。4.LaCl3对仔鼠海马不同区域SNK、SPAR和PSD95蛋白表达水平的影响。SNK蛋白表达水平随着染La剂量增加而增加,SPAR和PSD95的蛋白表达水平呈现下降趋势;LaCl3对仔鼠海马SPAR和PSD95蛋白共表达水平和共定位的影响。二者共表达水平和共定位程度均随染La剂量增加而减弱。5.LaCl3对仔鼠海马RAS mRNA转录和蛋白表达水平以及HRAS和RAP蛋白表达水平的影响。Ras的mRNA转录水平随着染La剂量的增加无明显变化;RAS和HRAS蛋白表达水平对照组相比均呈下降趋势;RAP的蛋白表达水平与对照组相比呈上升趋势。6.LaCl3对仔鼠海马RAS和RAP上游调节因子SNK、PSD95、RASGRF1、RAPGEF2、SYNGAP、SPAR mRNA转录及蛋白表达水平的影响。随染毒剂量升高,LaCl3剂量组RASGRF1、SPAR和PSD95 mRNA转录及蛋白表达水平均下降;SNK mRNA转录及蛋白表达水平呈现上升趋势;Rapgef2 mRNA转录水平无显着变化,但其蛋白表达水平上升;SYNGAP蛋白表达水平呈上升趋势。7.LaCl3对仔鼠海马RAS和RAP下游ERK和p-ERK蛋白表达水平的影响。随染毒剂量增加,ERK蛋白表达水平无显着性变化,p-ERK蛋白表达水平呈下降趋势。结论:1、LaCl3暴露可导致仔鼠学习记忆能力受损。2、LaCl3暴露引起仔鼠海马神经元尼氏体表达减少,神经元树突棘总密度降低,mushroom和stubby成熟型树突棘减少明显。3、LaCl3暴露引起仔鼠海马SNK蛋白表达增加,导致SPAR、PSD95和RASGRF1蛋白表达降低,RAPGEF2和SYNGAP蛋白表达增加,使得RAS和RAP蛋白表达异常以及下游ERK蛋白磷酸化减少,从而使神经元树突棘的密度和形态发生异常变化,影响仔鼠的学习记忆能力。
二、应用硫堇染色法对神经元尼氏体进行染色（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用硫堇染色法对神经元尼氏体进行染色（论文提纲范文）
（1）TNF-α-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血模型中的相关研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 SD大鼠脑缺血模型的建立及评价 |
| 引言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 TNF-α-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血模型中的相关研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 常压氧疗法对大鼠脑缺血模型的影响 |
| 引言 |
| 材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脑缺血环境中 NF-κB 通路调控下的 TNF-α表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 眼针对MCAO/R大鼠神经功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 眼针对MCAO/R大鼠缺血侧脑组织血管新生的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 眼针对MCAO/R大鼠脑组织缺血半暗带区域HIF-1α和Wnt3a/β-catenin/LEF1 信号转导通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 一 针刺治疗缺血性脑卒中研究进展 |
| 二 血管新生相关因子及信号传导通路在缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）靶向纳米输递体系用于重大脑部疾病治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 脑部疾病概述 |
| 1.2 多形胶质母细胞瘤(GBM) |
| 1.2.1 多形胶质母细胞瘤(GBM)概述 |
| 1.2.2 多形胶质母细胞瘤(GBM)的治疗现状 |
| 1.2.3 多形胶质母细胞瘤(GBM)的化学药物治疗的不足 |
| 1.2.4 多形胶质母细胞瘤(GBM)的纳米药物输递体系治疗 |
| 1.3 阿尔茨海默病(AD) |
| 1.3.1 阿尔茨海默病(AD)的病理特征 |
| 1.3.2 阿尔茨海默病(AD)的免疫治疗现状 |
| 1.3.3 阿尔茨海默病(AD)的免疫治疗的不足 |
| 1.3.4 阿尔茨海默病(AD)的免疫治疗输递体系 |
| 1.4 帕金森病(PD) |
| 1.4.1 帕金森病(PD)的病理特征 |
| 1.4.2 帕金森病(PD)的治疗现状 |
| 1.4.3 帕金森病(PD)的药物治疗的不足 |
| 1.4.4 帕金森病(PD)的纳米药物输递体系治疗 |
| 1.5 立题依据和研究目标 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 论文工作目标 |
| 第2章 聚合物纳米输递体系用于多形胶质母细胞瘤的治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验材料及试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 聚合物材料的制备与表征 |
| 2.2.4 两亲嵌段共聚物聚(赖氨酸-亮氨酸)poly(lysine-leucine)的ROS响应性的表征 |
| 2.2.5 两亲嵌段共聚物聚(赖氨酸-亮氨酸)poly(lysine-leucine)的临界胶束浓度(CMC)的表征 |
| 2.2.6 具有ROS响应性并包载DOX的聚(赖氨酸-亮氨酸)纳米颗粒(DOX@PLSPL)的组装与表征 |
| 2.2.7 DOX@PLSPL的血清稳定性的考察 |
| 2.2.8 DOX@PLSPL的DOX载药效率检测 |
| 2.2.9 DOX@PLSPL的DOX响应性释放检测 |
| 2.2.10 DOX@PLSPL的体外评价 |
| 2.2.11 DOX@PLSPL的体内评价 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 聚合物材料的制备与表征 |
| 2.3.2 两亲嵌段共聚物聚(赖氨酸-亮氨酸)poly(lysine-leucine)的ROS响应性的表征 |
| 2.3.3 两亲嵌段共聚物聚(赖氨酸-亮氨酸)poly(lysine-leucine)的临界胶束浓度(CMC)的表征 |
| 2.3.4 具有ROS响应性并包载DOX的聚(赖氨酸-亮氨酸)纳米颗粒(DOX@PLSPL)的组装与表征 |
| 2.3.5 DOX@PLSPL的血清稳定性的考察 |
| 2.3.6 DOX@PLSPL的DOX载药效率检测 |
| 2.3.7 DOX@PLSPL的DOX响应性释放检测 |
| 2.3.8 DOX@PLSPL的体外评价 |
| 2.3.9 DOX@PLSPL的体内评价 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 靶向纳米输递体系用于阿尔茨海默病的免疫治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验材料及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 靶向脂质分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-甘露糖苷(DSPE-PEG-Man)的制备与表征 |
| 3.2.4 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的组装与表征 |
| 3.2.5 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的体外评价 |
| 3.2.6 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的体内评价 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 靶向脂质分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-甘露糖苷(DSPE-PEG-Man)的制备与表征 |
| 3.3.2 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的组装与表征 |
| 3.3.3 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的体外评价 |
| 3.3.4 靶向纳米输递体系(MPEG-Chol-MPLA-P)的体内评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基因-化药联合递送体系用于帕金森病的可示踪协同治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料及试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 高分子材料的合成 |
| 4.2.4 纳米颗粒的制备 |
| 4.2.5 纳米颗粒的表征 |
| 4.2.6 纳米颗粒的siRNA结合能力 |
| 4.2.7 体外模拟siRNA的ROS响应释放 |
| 4.2.8 GC-TRIO的质子缓冲效应 |
| 4.2.9 药物递送体系的体外评价 |
| 4.2.10 药物递送体系的体内评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 高分子的合成与表征 |
| 4.3.2 SPIONs的合成与亲水转相 |
| 4.3.3 siRNA的负载与表征 |
| 4.3.4 药物递送体系的体外评价 |
| 4.3.5 药物递送体系的体内评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 主要结论 |
| 5.3 创新点总结 |
| 5.4 今后的工作建议 |
| 参考文献 |
| 附录 补充数据 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 阿尔茨海默病概述 |
| 1.2 阿尔茨海默病的发病机制 |
| 1.2.1 Aβ级联假说 |
| 1.2.2 Tau蛋白假说 |
| 1.2.3 胆碱能假说 |
| 1.2.4 氧化应激假说 |
| 1.2.5 微生物感染性假说 |
| 1.2.6 微生物-肠-脑轴假说 |
| 1.3 阿尔茨海默病的治疗现状 |
| 1.3.1 胆碱酯酶抑制剂 |
| 1.3.2 NMDA受体拮抗剂 |
| 1.3.3 靶向Aβ的治疗 |
| 1.3.4 靶向tau蛋白的治疗 |
| 1.3.5 针对神经炎症的治疗 |
| 1.3.6 靶向肠脑轴的治疗 |
| 1.3.7 天然产物在AD治疗上的应用 |
| 1.4 壳寡糖概述 |
| 1.4.1 COS的制备和分离纯化 |
| 1.4.2 COS及其衍生物在神经保护中的潜在应用及机制 |
| 1.4.3 COS的吸收和代谢 |
| 1.5 立题依据和研究思路 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第2章 壳寡糖的血脑屏障透过性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 COS的制备 |
| 2.3.2 微流控芯片的制造与组装 |
| 2.3.3 基于微流控芯片的血脑屏障微系统建立 |
| 2.3.4 Transwell血脑屏障模型构建 |
| 2.3.5 表观渗透率检测 |
| 2.3.6 免疫荧光染色 |
| 2.3.7 体外模型探究COS能否透过血脑屏障 |
| 2.3.8 COS的荧光标记 |
| 2.3.9 动物活体成像验证COS能否透过血脑屏障 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 COS的脱乙酰度 |
| 2.4.2 COS的聚合度分布 |
| 2.4.3 Transwell血脑屏障模型 |
| 2.4.4 微流控芯片血脑屏障模型 |
| 2.4.5 动物活体成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第3章 壳寡糖通过影响Aβ聚集减轻其介导的神经毒性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 单一聚合度的壳寡糖的制备 |
| 3.3.2 Aβ42蛋白预处理 |
| 3.3.3 Aβ42样品制备 |
| 3.3.4 COS影响Aβ聚集的体系设置 |
| 3.3.5 ThT荧光实验 |
| 3.3.6 刚果红染色实验 |
| 3.3.7 圆二色光谱实验 |
| 3.3.8 透射电镜观察Aβ的聚集形态 |
| 3.3.9 微量热涌动仪检测COS与Aβ的互作 |
| 3.3.10 分子动力学模拟模型和参数 |
| 3.3.11 细胞培养 |
| 3.3.12 MTT检测细胞活力 |
| 3.3.13 细胞凋亡检测 |
| 3.3.14 氧化应激水平检测 |
| 3.3.15 细胞RNA提取 |
| 3.3.16 实时荧光定量PCR |
| 3.3.17 荧光染色定量分析方法 |
| 3.3.18 数据统计和分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 COS对Aβ42的聚集抑制效果 |
| 3.4.2 COS对Aβ42纤维状聚体的分解作用 |
| 3.4.3 TEM观察COS对Aβ42聚集体形貌的影响 |
| 3.4.4 COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.5 不同DP的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.6 不同DDA的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.7 COS与Aβ42的相互作用研究 |
| 3.4.8 不同DP的COS与Aβ42的相互作用 |
| 3.4.9 不同DDA的COS与Aβ42的相互作用 |
| 3.4.10 分子动力学模拟探究COS影响Aβ42聚集的分子机制 |
| 3.4.11 COS对Aβ42聚集引起的细胞毒性的影响 |
| 3.4.12 COS对Aβ42诱导产生的小胶质细胞功能紊乱的影响 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第4章 壳寡糖对AD模型小鼠认知功能的改善及其相关机制探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Aβ42寡聚体制备 |
| 4.3.2 AD小鼠模型构建 |
| 4.3.3 Morris水迷宫实验 |
| 4.3.4 旷场实验 |
| 4.3.5 新物体识别实验 |
| 4.3.6 抗生素混合剂处理获得伪无菌小鼠 |
| 4.3.7 粪便菌群移植 |
| 4.3.8 组织样品的采集与储存 |
| 4.3.9 血清中和脑组织匀浆中的炎症因子检测 |
| 4.3.10 免疫组织化学分析 |
| 4.3.11 免疫荧光染色 |
| 4.3.12 免疫荧光染色定量分析方法 |
| 4.3.13 结肠组织的RNA提取 |
| 4.3.14 实时荧光定量PCR |
| 4.3.15 16S rRNA V3和V4区扩增子测序 |
| 4.3.16 生物信息学分析 |
| 4.3.17 非靶代谢组分析 |
| 4.3.18 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AD小鼠模型构建 |
| 4.4.2 COS对AD小鼠行为学的影响 |
| 4.4.3 COS对AD小鼠脑内反应性胶质细胞增生的影响 |
| 4.4.4 COS对AD小鼠海马区神经元的影响 |
| 4.4.5 COS对AD小鼠突触功能损伤的影响 |
| 4.4.6 COS对AD小鼠肠道屏障完整性的影响 |
| 4.4.7 COS对AD小鼠肠道炎症的影响 |
| 4.4.8 COS对AD小鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.4.9 COS对AD小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 4.4.10 COS对AD小鼠肠道菌群代谢产物的影响 |
| 4.4.11 肠道菌群在COS治疗中的作用 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究结论 |
| 5.3 本论文创新点 |
| 5.4 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 自制脊髓打击器与NYU打击器建立脊髓损伤模型研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 6.不足和展望 |
| 第二部分 抵当汤加减调节AQP4 表达对SCI大鼠脊髓水肿的作用研究 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足与展望 |
| 第三部分 抵当汤加减含药血清对反应性星形胶质细胞的活化、迁移及神经生长相关细胞因子分泌的作用 |
| 1.目的 |
| 2.材料 |
| 3.实验方法 |
| 4.实验结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 7.不足和展望 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件1 自制简易打击器与NYU打击器 |
| 附件2 脊髓打击损伤模型 |
| 附录3 BBB评分 |
| 附录4 Reuter评分 |
| 附录5 综述 水通道蛋白在急性脊髓损伤中的作用机制 |
| References |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 抑郁症现代医学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抑郁症中医药研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 1. 抑郁症病理机制中的线粒体损伤 |
| 2. 线粒体能量代谢障碍与突触可塑性损伤 |
| 3. 线粒体生物合成异常与抑郁症神经元突触重塑 |
| 4. 从“脾”论治抑郁症或成为中医治疗的新途径 |
| 参考文献 |
| 实验一 醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁大鼠行为学及海马神经元损伤的保护作用研究 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α介导的线粒体生物合成研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨醒脾解郁方含药血清对皮质酮诱导海马神经元损伤突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨突触微环境对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响及醒脾解郁方干预效应 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、初步结论 |
| 三、存在不足 |
| 四、创新点 |
| 五、展望 |
| 第四部分 附录 |
| 附录1: 致谢 |
| 附录2 攻读学位期间发表的学术论文及参与课题情况 |
| 附录3 个人简历 |
（7）ZC3H12D在脑缺血-再灌注损伤中抗炎作用及机制（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织中ZC3H12D和P65蛋白的表达变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 ZC3H12D对氧糖缺失/复氧损伤PC12细胞炎症反应和细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 ZC3H12D通过调控NF-κB信号通路和降低炎症因子mRNA稳定性在脑缺血再灌注损伤中发挥抗炎作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脑缺血-再灌注损伤中线粒体自噬的作用及治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 围产期缺氧缺血性脑损伤的免疫调节机制及潜在治疗 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）p75NTR在PTSD发生中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写标注 |
| 绪论 |
| 1.PTSD及其研究现状 |
| 2.p75NTR的分子结构及生物学功能 |
| 3.p75NTR可能通过形成受体复合物参与PTSD的发生 |
| 第一章 p75NTR基因敲除和过表达动物的获得 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 p75NTR基因过表达AAV病毒的包装 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 主要实验试剂配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 实验进程安排 |
| 1.2.2 p75NTR基因敲除/过表达动物的获得 |
| 1.2.2.1 p75NTR基因敲除小鼠基因型鉴定 |
| 1.2.2.1.1 新生鼠尾部取材及DNA模板制备 |
| 1.2.2.1.2 多重PCR扩增目的片段 |
| 1.2.2.2 p75NTR基因敲除小鼠p75NTR表达鉴定 |
| 1.2.2.2.1 免疫荧光 |
| 1.2.2.2.2 Western blot |
| 1.2.3 p75NTR基因过表达小鼠的制备 |
| 1.2.3.1 p75NTR基因过表达AAV病毒载体构建和包装 |
| 1.2.3.2 侧脑室注射 |
| 1.2.3.3 病毒感染效率及p75NTR的表达鉴定 |
| 1.2.4 PTSD小鼠模型的制备及实验分组 |
| 1.2.4.1 PTSD小鼠模型的制备 |
| 1.2.4.2 实验动物分组 |
| 1.2.5 统计学处理方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 p75NTR基因敲除小鼠鉴定 |
| 1.3.1.1 p75NTR基因敲除小鼠基因型鉴定 |
| 1.3.1.2 p75NTR基因敲除小鼠的p75NTR表达鉴定 |
| 1.3.2 p75NTR基因过表达AAV病毒侧脑室注射 |
| 1.3.2.1 p75NTR基因过表达AAV病毒载体测序鉴定 |
| 1.3.2.2 p75NTR基因过表达AAV病毒滴度测定 |
| 1.3.2.3 病毒感染效率及p75NTR的表达鉴定 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 p75NTR对PTSD动物的行为学影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 行为学观察运动功能差异和学习记忆能力强弱 |
| 2.2.1.1 旷场实验 |
| 2.2.1.2 高架十字迷宫实验 |
| 2.2.1.3 Morris水迷宫实验 |
| 2.2.2 统计学处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 旷场实验 |
| 2.3.2 高架十字迷宫实验 |
| 2.3.3 Morris水迷宫实验 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 p75NTR对PTSD发生过程中海马组织病理影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要实验器材 |
| 3.1.2 主要实验试剂 |
| 3.1.3 主要实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 石蜡切片的制备 |
| 3.2.2 HE染色 |
| 3.2.3 尼氏(Nissl)染色 |
| 3.2.4 高尔基(Golgi-Cox)染色 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HE染色 |
| 3.3.2 尼氏(Nissl)染色 |
| 3.3.3 高尔基(Golgi-Cox)染色 |
| 3.3.4 小结 |
| 第四章 p75NTR在PTSD发生过程中的分子机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要实验器材 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验试剂配置 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TUNEL染色 |
| 4.2.2 免疫荧光染色 |
| 4.2.3 Western blot |
| 4.2.4 数据统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 细胞凋亡 |
| 4.3.2 细胞自噬 |
| 4.3.3 突触可塑性 |
| 4.4 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（10）氯化镧对子代大鼠海马树突棘可塑性及RAS和RAP相关蛋白的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂与药品 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验动物及分组 |
| 2.3 测定指标及方法 |
| 2.3.1 神经行为学测试 |
| 2.3.2 仔鼠海马神经元尼氏体观察 |
| 2.3.3 仔鼠海马神经元树突棘变化 |
| 2.3.4 仔鼠海马组织中SNK与SPAR、SNK与PSD95、SPAR与PSD95表达及共定位情况的检测 |
| 2.3.5 仔鼠海马Snk、Psd95、Spar、Rasgrf1、Rapgef2、Ras、GapdhmRNA转录水平的检测 |
| 2.3.6 仔鼠海马SNK、PSD95、SPAR、RAPGEF2、RASGRF1、SYNGAP、ERK、p-ERK、HRAS、RAS、RAP1蛋白表达水平的检测 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 LaCl_3对仔鼠学习记忆能力的影响 |
| 3.2 LaCl_3对仔鼠海马CA1、CA3、DG区神经元中尼氏体表达水平的影响 |
| 3.3 LaCl_3对仔鼠海马神经元树突棘的影响 |
| 3.4 LaCl_3对仔鼠海马组织不同区域SNK和PSD95表达水平的影响 |
| 3.5 LaCl_3对仔鼠海马组织不同区域SNK和SPAR表达水平的影响 |
| 3.6 LaCl_3对仔鼠海马组织内PSD95和SPAR蛋白共表达及共定位情况的影响 |
| 3.7 LaCl_3对仔鼠海马中Ras mRNA转录和蛋白表达水平及HRAS、RAP1蛋白表达水平的影响 |
| 3.8 LaCl_3对仔鼠海马组织中SNK、PSD95、SPAR、RAPGEF2、RASGRF1 mRNA转录和蛋白表达水平及SYNGAP蛋白表达的影响 |
| 3.9 LaCl_3对仔鼠海马组织中RAS和RAP下游ERK及p-ERK蛋白表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 神经元突起与神经系统疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 实践报告 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、应用硫堇染色法对神经元尼氏体进行染色（论文参考文献）
- [1]TNF-α-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血模型中的相关研究[D]. 贾巧荣. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]基于Wnt3a/β-catenin/LEF1信号通路探讨眼针促MCAO/R大鼠血管新生的作用机制[D]. 浦延鹏. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]靶向纳米输递体系用于重大脑部疾病治疗的研究[D]. 石竹砚. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2021(01)
- [4]壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探[D]. 朱立猛. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2021(01)
- [5]通腑逐瘀法指导下抵当汤加减调控AQP4表达治疗大鼠急性脊髓损伤的作用机制研究[D]. 吴子健. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [6]基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响[D]. 任非非. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]ZC3H12D在脑缺血-再灌注损伤中抗炎作用及机制[D]. 彭丽佳. 昆明医科大学, 2021(01)
- [8]新生儿缺氧缺血性脑损伤后脑内髓系细胞吞噬—炎症失衡参与突触损伤的机制研究[D]. 闵颖俊. 昆明医科大学, 2021
- [9]p75NTR在PTSD发生中的作用与机制研究[D]. 汤竣杰. 重庆理工大学, 2021(02)
- [10]氯化镧对子代大鼠海马树突棘可塑性及RAS和RAP相关蛋白的影响[D]. 王立平. 中国医科大学, 2021(02)