一、Experimental Study of Effect of Corticosterone on Primary Cultured Hippocampal Neurons and Their Ca~(2+) /CaMKⅡ Expression（论文文献综述）
Yun-Fei Lai,Hao-Yu Wang,Rui-Yun Peng[1]（2021）在《Establishment of injury models in studies of biological effects induced by microwave radiation》文中研究表明Microwave radiation has been widely used in various fields, such as communication, industry, medical treatment, and military applications. Microwave radiation may cause injuries to both the structures and functions of various organs, such as the brain, heart, reproductive organs, and endocrine organs, which endanger human health. Therefore, it is both theoretically and clinically important to conduct studies on the biological effects induced by microwave radiation. The successful establishment of injury models is of great importance to the reliability and reproducibility of these studies. In this article, we review the microwave exposure conditions, subjects used to establish injury models, the methods used for the assessment of the injuries, and the indicators implemented to evaluate the success of injury model establishment in studies on biological effects induced by microwave radiation.
任非非[2]（2021）在《基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响》文中提出目的:观察AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成对抑郁大鼠海马神经元突触可塑性的影响及醒脾解郁方干预效应。方法:实验研究分为四部分。第一部分:140只雄性SD大鼠随机分为空白组（CON）、模型组（MOD）、醒脾解郁方组（XPJYF）、草酸艾司西酞普兰组（EOT）、醒脾解郁方联合草酸艾司西酞普兰组（XPJYF+EOT）。每组根据应激时间各分为3w、6w组。除CON外,其余各组采用慢性束缚应激（CRS）造模,共21d。各组造模的同时给予相应药物干预。造模前及造模第3 w、6 w时进行行为学观察。造模3 w时评价脾虚程度,结合行为学实验,评价模型成功与否。取材后以HE染色和尼氏染色观察海马CA1区神经元病理变化及XPJYF干预效应。第二部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后观察海马CA1区神经元突触及线粒体超微结构;分析线粒体及神经元突触体视学指标;高尔基染色观察神经元轴树突分支变化;提取海马突触体,免疫荧光染色观察突触重塑蛋白表达;Western blot检测线粒体合成蛋白含量;检测海马线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ及线粒体酶活性。第三部分:制备XPJYF低、中、高剂量组含药血清;体外分离、培养原代海马神经元细胞并鉴定;采用CCK8法进行XPJYF细胞毒性实验;建立皮质酮（CORT）诱导海马神经元损伤模型,分为 CON、CORT、CORT+X（H）、（M）、（L）、CORT+E、CORT+E+X（H）、（M）、（L）共9组。以细胞免疫荧光观察SYN、PSD-95表达及海马神经元线粒体成像;Western blot检测线粒体生物合成及突触重塑蛋白表达;ELISA及RT-PCR检测5-HT、DA及其受体情况。第四部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后以免疫荧光三标染色观察海马CA1区NeuN/CD31/GFAP表达;RT-PCR检测海马AMPK/SIRT1/PGC-1α通路基因表达;免疫组化及 Western blot 检测 NeuN、GFAP、VEGF、Collagen Ⅳ蛋白表达。结果:1.第一部分1.1宏观表征:造模前大鼠状态良好,反应灵敏,活动自如。造模3 w后,反应降低,神态倦怠,活动减少,毛发干枯或发黄,粪便逐渐变稀,至6 w时表现更明显,各用药组较模型组有改善。1.2体质量变化:模型各组大鼠体重较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各用药组体重增加（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药3 w、联合各组体重增加（P<0.01,P<0.05）,西药6 w组降低（P<0.05）。联合各组体重较西药组增加（P<0.01,P<0.05）。1.3行为学:模型各组糖水偏好率（SPT）较空白组降低（P<0.01）,强迫游泳不动时间（FST）延长（P<0.01）。与模型组比较,西药、联合各3 w及各用药6w组SPT升高,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。联合各组SPT较中药、西药组升高（P<0.01,P<0.05）,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。与同组别基线比较,各组各时间点SPT降低（P<0.01）,模型各组及中药、西药各6 w组FST延长（P<0.01,P<0.05）。1.4血清淀粉酶、尿D-木糖排泄率比较:造模3 w后血清淀粉酶和尿D-木糖排泄率均降低（P<0.01）,至造模6周时更低（P<0.01）。1.5海马CA1区病理改变:HE染色:空白组海马CA1区神经元数量、分布、形态均无异常,圆形胞核清晰居中。模型3w组神经元数量减少,排列及形态不规则,细胞大小不一,部分呈三角形,细胞核深染、固缩,核仁显示不清;至6w时损伤进一步加重。各用药组有不同程度改善,以中药6 w组和联合组较为明显。尼氏染色:空白组海马CA1区神经元正常分布,胞质内可见丰富的尼氏小体,近胞核处呈“虎斑样”,远端呈细颗粒样,核仁清晰。模型3 w组细胞排列散乱,胞质内尼氏小体减少。至6w时,损伤加重,细胞皱缩明显,部分细胞尼氏体减少,并可见中央性染色质溶解现象。各用药组损伤逐渐恢复,以西药3 w组及中药6 w组明显。2.第二部分2.1神经元超微结构:正常组神经元突起较多,线粒体正常,突触结构完整,突触小泡较多。造模3 w后,线粒体肿胀,嵴断裂,突触小泡数量减少。至造模6 w,损伤加重,突触间隙显示不清,突触小泡减少,聚集分布,线粒体膜破坏,嵴断裂,基质空泡样变。各用药组上述损伤减轻。2.2线粒体体视学:模型各组Vvm较空白组升高（P<0.01）,NM、δ、δm降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组Vvm降低（P<0.01,P<0.05）,各6 w组NM升高（P<0.01）,中药、联合各组及西药6 w组δ、δm升高（P<0.01,P<0.05）。较中药组,西药6 w组δ、联合6 w组Vvm降低（P<0.01）,联合各组δm升高（P<0.01,P<0.05）。2.3突触体视学:模型各组数密度（Nv）、面密度（Sv）、突触小泡面数密度（NS）均较空白组降低（P<0.01）。中药、联合各6 w组Nv、Sv、Ns较模型组升高（P<0.01,P<0.05）。2.4高尔基染色:模型各组Sholl交点数及树突棘较空白组减少（P<0.01）。中药、联合各组Sholl交点数较模型组增多（P<0.01,P<0.05）,中药、西药各6 w组及联合各组树突棘密度升高（P<0.01,P<0.05）,且联合6 w组较中药、西药各6w组升高（P<0.05）。2.5突触体突触重塑蛋白:与空白组比较,模型3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01）,6w组降低（P<0.05）,各组SYN、syntaxin 1均降低（P<0.01）。与模型组比较,中药、联合各组及西药3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01,P<0.05）,中药、联合各组SYN升高（P<0.01）,中药、西药及联合各6 w组syntaxin 1升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药6 w组SYN降低（P<0.05）,联合6 w组GAP-43增加（P<0.01）。2.6线粒体生物合成蛋白:模型各组SIRT1、PGC-1α、AMPK-α1、Tfam、NRF1较空白组均降低（P<0.01）。与模型组比较,西药3 w组SIRT1和AMPK-α1、联合各组SIRT1、PGC-1α、Tfam升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合3 w组AMPK-α1、6w组PGC-1α表达升高（P<0.01）。3.第三部分3.1细胞毒性实验:经免疫荧光鉴定,培养的海马神经元符合神经元细胞特征。经CCK8实验,确定醒脾解郁方含药血清浓度为高剂量组10%、中剂量组10%和低剂量组20%,作用时间确定为24h。3.2线粒体生物合成蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组SIRT1、PGC-1α、NRF1、Tfam 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 组 SIRT1、NRF1、Tfam 升高（P<0.01）,CORT+E 组 SIRT1 降低（P<0.05）,CORT+X（H）组PGC-1α 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+X（H）组 PGC-1α、Tfam 升高（P<0.05）,CORT+E+X（M）组 NRF1、Tfam 升高（P<0.01）。3.3突触重塑蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组GAP-43、SYN、PSD-95 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 各组 GAP-43、SYN 升高（P<0.01）,CORT+X（H）组 PSD-95 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 GAP-43、SYN、PSD-95 升高（P<0.01,P<0.05）。3.4 5-HT、DA及其受体mRNA含量:与CON组比较,CORT组、CORT+E组5-HT、DA、5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X（H）组 5-HT、DA 升高（P<0.05）,CORT+E 组 5-HT 降低（P<0.05）,CORT+X 的 H、M组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01）。与 CORT1+E 组比较,CORT+E+X（H）组 5-HT 升高（P<0.05）,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01,P<0.05）。4.第四部分4.1线粒体合成基因表达:模型各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组 SIRT1 mRNA、PGC-1αmRNA、AMPK-α1 mRNA 均升高（P<0.01）,中药6w组、西药及联合各组NRF1 mRNA升高（P<0.01）,西药3 w组、中药及联合各组Tfam mRNA表达均升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA、NRF1 mRNA 均升高（P<0.01）,西药 3 w 组 SIRT1 mRNA升高（P<0.01）。4.2突触微环境蛋白表达:模型各组NeuN、GFAP、VEGF较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,中药及联合各组NeuN、GFAP、VEGF均升高（P<0.01,P<0.05）,西药各组GFAP升高（P<0.01）,西药3 w组VEGF升高（P<0.01）。与中药组比较,西药各组GFAP 降低（P<0.05）,联合各组 GFAP 升高（P<0.01）,联合 3 w 组 VEGF 升高（P<0.05）。结论:1.慢性束缚应激3周时,动物模型符合肝郁脾虚型抑郁症标准,脑内海马CA1区神经元损伤,且随应激时间延长,损伤程度加重。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可不同程度减轻神经元损伤,改善抑郁样行为,中药的远期保护优势较西药明显,且以两者联合应用作用更为显着;2.抑郁模型大鼠脑内海马CA1区神经元突触超微结构破坏,线粒体损伤,突触重塑功能降低,与AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成减少直接相关。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可动态调控该信号通路,促进海马神经元突触重塑,但二者作用的优势环节不同,西药在调节神经递质方面更具优势,而中药在改善线粒体功能方面更为明显,且中药的远期作用效果优于西药。3.抑郁症海马神经元突触微环境中星形胶质细胞、微血管内皮细胞及微血管基底膜损伤,与神经元突触重塑相关。中药醒脾解郁方可通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路增加线粒体生物合成,保护突触微环境,促进抑郁症神经重塑,作用较西药草酸艾司西酞普兰更具优势,且中西药联合应用效果显着。
胡文继[3]（2021）在《猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究》文中研究说明随着各个国家老龄化加快的不可避免,全球目前几乎每3 s就会新增1名阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease,AD）确诊患者。AD是最主要的痴呆形式之一,会导致记忆力和学习等方面的进行性下降,这对于社会和家庭的负担将会大大增加。AD的发病机制复杂,且环环相扣,目前围绕AD的治疗策略集中于改善β淀粉样蛋白（β-Amyloid,Aβ）斑块异常积聚、促进乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）释放和阻断谷氨酸能神经传递等,但仍存在着药效不稳定、存在毒副作用等诸多问题,且单一靶点的治疗策略似乎无法实现对病程的控制。因此,作用于多靶点、全身性的天然药物作为一种潜在的新型疗法,逐渐成为AD治疗的研究热点。真菌因营养成分丰富,在许多国家被广泛用作日常饮食的一部分。猴头菌作为一种高蛋白、低脂肪的食物,除味道鲜美、食之不易发胖外,还能够滋补强身、养胃安神,因此也是一味珍贵的中药。随着健康产业的发展,人们对于名贵真菌的需求日益增加。因此建立系统的猴头菌发酵体系,对于猴头菌及下游产业的长期发展具有很大的助益。多糖是猴头菌的主要活性成分,猴头菌多糖已经被证实具有抗氧化、调节免疫、消除炎症和促进神经发育等活性。尚未有研究在APP/PS1小鼠模型中,对猴头菌多糖的抗AD机制进行探索。因此基于以上理论基础,以猴头菌液体发酵菌丝体多糖作为研究对象,在明确其纯化手段和结构性质的同时,考察其对AD的保护活性,探究分子机制。本课题的完成对于多糖的药效药理研究,和中药的现代化开发,具有提供思路和数据支持的意义。本研究首先结合满意度函数、单因素实验、筛选试验设计和中心复合设计,建立了以高产菌丝体和胞内多糖为指标的液体深层发酵工艺。培养基配方为（单位:g/L）:蔗糖30、酵母浸粉19.83、胰蛋白胨5、（NH4）2SO4 5、KH2PO4 4、Mg SO42.58、Zn SO4 0.02、Ca Cl2 0.01和维生素B1 0.03。发酵参数为:发酵温度26℃,转速200 r/min,培养基初始p H 6.5,接种量5%,进行为期6 d的发酵。随后结合多种检测手段,明确了猴头菌发酵菌丝体的主要活性成分,包括总蛋白（48.5%）、甘露醇（8.90 g/kg）、总黄酮（1.04 g/kg）、总三萜（1.13 g/kg）和17种氨基酸的含量。与野生猴头菌相比,猴头菌液体深层发酵菌丝体具有相近的活性成分,这为发酵猴头菌的活性研究探索和机制研究提供了思路。随后,制备了富集多糖的猴头菌水提物（Hercium erinaceus extract,HE）,并考察了其神经保护活性。体外研究显示,HE促进PC12细胞的神经元样分化,同时对细胞的增殖无影响。HE通过改善左旋谷氨酸（L-Glutamate,L-Glu）诱导损伤形成的线粒体功能障碍、缓解胞内Ca2+超载同时抑制活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）积累,提升了细胞活力、产生了抗凋亡的作用。在右旋半乳糖（D-Galactose,D-gal）联合Al Cl3诱导的AD小鼠模型中,HE在显现安全性的基础上,能够改善小鼠的空间记忆、学习能力和耐力,并通过增加ACh和乙酰胆碱转移酶（Choline acetyl transferase,Ch AT）水平发挥抗AD的作用。为了获得具有神经保护活性的纯化多糖,结合L-Glu诱导的小鼠海马神经元细胞系（HT22）细胞损伤模型,建立了结合神经保护的指标筛选纯化猴头菌多糖的体系,最终获得纯化多糖（PHEB）,并对其结构和理化特性进行了分析。PHEB的纯度约为96.9%,在紫外光谱分析中无明显蛋白/核酸成分（260/280 nm处无吸收峰）;其分子量为36.1 k Da,是不规则线形的均一多糖。PHEB主要由6种单糖组成,且摩尔比为岩藻糖（Fucose,Fuc）∶Gal∶葡萄糖（Glucose,Glc）∶木糖（Xylose,Xyl）∶甘露糖（Mannose,Man）∶葡萄糖醛酸（Glucuronic Acid,Glc UA）=2.622∶9.372∶66.660∶1.956∶13.514∶4.821。红外光谱分析显示PHEB包含糖类的特征峰,如O-H的伸缩振动、C-H伸缩振动、C-O对称伸缩振动和O-H变角振动等。甲基化分析显示多糖最主要的糖苷键残基为6-Glc（p）和3-Glc（p）,说明其主链为葡聚糖。通过核磁共振对所有糖苷键信号进行归属,最终明确了PHEB的主要糖苷键组成。最后,利用APP/PS1小鼠模型,对具有神经保护活性的多糖PHEB的抗AD作用和分子机制进行了深入研究。结果表明,PHEB能够改善小鼠在行为学测试中的表现;病理观察显示PHEB改善了AD小鼠脑中的神经元损伤,且对其它脏器无毒副作用;免疫组化染色结果显示PHEB减少小鼠海马区的Aβ1-42沉积、tau的过度磷酸化和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）的表达;调节胆碱能因子（ACh、Ch AT和乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase,ACh E））、氧化应激因子（ROS、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、和抗氧化酶）和Aβ1-42在海马、下丘脑、垂体和血清中的水平。通过蛋白质组学和生物信息学筛选PHEB抗AD活性可能的靶点和通路,筛选得到52种具有表达显着差异的蛋白。基因数据库提示这些蛋白主要涉及Ca2+平衡、谷氨酸受体表达、突触内膜的形成与神经发育,且存在明确的互作关系。因此本研究采用蛋白免疫印迹（Western Blotting）围绕Ca2+平衡对PHEB的分子机制进行进一步研究。结果表明PHEB的作用机制可能是通过核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2）途径的激活,抑制氧化应激介导的Ca2+超载和Ca2+/钙调蛋白依赖激酶（Calcium/calmodulin kinase,Ca MK）II/IV的磷酸化表达增加,改善神经元细胞内Ca2+平衡,实现改善突触发育和抗AD作用,为改善AD症状、提高认知和记忆的药品及保健品的开发提供理论依据。
Raheel Khan,Don Kulasiri,Sandhya Samarasinghe[4]（2021）在《Functional repertoire of protein kinases and phosphatases in synaptic plasticity and associated neurological disorders》文中提出Protein phosphorylation and dephosphorylation are two essential and vital cellular mechanisms that regulate many receptors and enzymes through kinases and phosphatases. Ca2+-dependent kinases and phosphatases are responsible for controlling neuronal processing; balance is achieved through opposition. During molecular mechanisms of learning and memory, kinases generally modulate positively while phosphatases modulate negatively. This review outlines some of the critical physiological and structural aspects of kinases and phosphatases involved in maintaining postsynaptic structural plasticity. It also explores the link between neuronal disorders and the deregulation of phosphatases and kinases.
李姿蓉,韩远山,吴梦瑶,刘检,金狮,张熙,王宇红[5]（2020）在《复方柴金解郁片通过改善海马神经元突触功能发挥抗抑郁作用（英文）》文中研究表明目的探讨复方柴金解郁片（CJJYT）对抑郁症认知障碍的改善作用及其潜在机制。方法体外实验中,从胎鼠全脑中分离海马,进一步培养海马神经元细胞;实验前18 h,除对照组外,每组均加50μM CORT构建抑郁环境;建立模型后,空白血清组加10%空白血清,CJJYT组、文拉法辛组分别加入对应10%含药血清,空白组和模型组则加入等体积培养液。检测各组海马神经元细胞内Ca2+平均荧光强度;记录m EPSC电流幅度和频率,评估海马神经元的突触功能。此外,通过免疫荧光染色,高内涵分析海马神经元突触可塑性相关蛋白SYN-α、NR2A、NR2B、PSD-95、Ca MKⅡ和Syn GAP的表达;采用反转录聚合酶链反应检测SYN-α、 NR2A、 NR2B、PSD-95、Ca MKⅡ和Syn GAP的m RNA表达。在体内实验中,除对照组外,其他大鼠均孤笼饲养,并采用慢性不可预知性应激刺激复制抑郁模型,并给予相应的药物干预。通过行为学测试评估抑郁大鼠的学习、记忆能力及其他认知能力;采用酶联免疫吸附测定法检测各组大鼠CORT水平;采用Golgi-Cox染色观察海马CA1和DG神经元突触形态的变化。结果体外实验:CJJYT干预降低了海马神经元细胞内Ca2+平均荧光强度（P <0.05）,并降低m EPSC的频率和电流幅度（P <0.05）,从而抑制了突触后受体的过度活动。CJJYT干预降低了海马神经元SYN-α,NR2A,NR2B和PSD-95的蛋白表达和m RNA表达（P <0.05）;增加Ca MKⅡ和Syn GAP蛋白表达和m RNA的表达（P <0.05）,从而改善海马神经元的突触可塑性。在体内,CJJYT干预可改善蔗糖偏爱,自主活动,Morris水迷宫测试的学习和记忆能力（P <0.05）,抑制食欲和增加强迫游泳测试绝望感（P <0.05）;CJJYT干预可降低CORT水平（P <0.05）,促进海马神经元突触损伤的修复。结论 CJJYT可以改善大鼠海马的突触功能,对海马神经元有显着的保护作用,可修复海马神经元的结构损伤,提高抑郁模型大鼠的认知能力,其改善认知的机制可能与SYN-α/NR及其下游神经递质的传递和功能有关。
左媛宜[6]（2020）在《NaN3对大鼠纹状体神经元和PC12细胞凋亡的作用及其机制》文中研究指明[目的]NaN3（sodium azide,NaN3）是一种剧毒物质,在其生产、加工过程中可通过人体呼吸道、消化道、皮肤吸收引起急、慢性中毒,导致全身多系统损伤。在人体各个组织器官中,神经系统的耗氧量巨大,对缺氧最敏感,耐受性最小,反应最剧烈,是NaN3主要的毒性靶器官。目前已有多项研究显示NaN3急性中毒可诱导大鼠脑、尾-壳核、大脑皮层、海马、小脑皮层和丘脑发生病理改变,同时伴有大鼠脑内神经元的凋亡。本实验以大鼠为研究对象及PC12细胞为脑内多巴胺能神经元模型,研究NaN3对大鼠纹状体神经元及PC12细胞凋亡的作用及潜在的作用机制。[方法]动物实验:32只实验SD雄性大鼠随机分为4组,每组8只,分为对照组、NaN3低剂量组（1.5mg/kg）、中剂量组（3mg/kg）及高剂量组（6mg/kg）进行腹腔注射,每日6次,每次注射间隔0.5h,连续6天,对照组大鼠给予同等体积的生理盐水作为实验对照。观察各组大鼠的中毒症状,给药后的第7天,各组大鼠经眼眶取血及心脏灌注固定,检测各组SD大鼠血液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽（glutahione,GSH）及乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）的活性。取脑组织中纹状体进行HE染色并观察其病理改变,应用免疫组织化学法检测凋亡相关基因 Caspase-3,B-cell lymphoma 2（Bcl-2）,Bcl-2-associated X protein（Bax）及细胞色素 C（cytochrome c,Cyt-c）蛋白的表达。体外实验:采取不同浓度（0,5,10,20,40 and 80 mM）的NaN3分别诱导PC12细胞（12,24,48和72 h）后检测PC12细胞存活率,建立神经细胞凋亡模型。不同浓度的NaN3分别诱导PC12细胞（12,24,48和72 h）后,使用CCK-8细胞计数试剂盒检测PC12细胞在不同时间点的存活率。DAPI染色在荧光显微镜下观察凋亡细胞及其细胞核形态的变化,使用Annexin V-FITC和PI双染、mitochondrial membrane potential（△Ψm）试剂盒,通过流式细胞仪检测各处理组的PC12细胞凋亡率及其线粒体膜电位的变化。同时使用含DCFH-DA荧光探针的试剂盒检测各处理组的PC12细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。使用ATP检测试剂盒通过Luminometer检测各处理组PC12细胞中ATP的水平。收集各组PC12细胞,提取细胞总蛋白,采用western-blot方法检测各处理组PC12细胞内B-cell lymphoma 2（Bcl-2）,Bcl-2-associated X protein（Bax）,procaspase-3,细胞色素 C（cytochrome c,Cyt-c）,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅酶激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor γco-activator 1-α,Pgc-1α）,核呼吸因子（nuclear respiratory factor,Nrf-1/2）,线粒体转录因子（mitochondrial transcription factor A,Tfam）,线粒体呼吸链复合物Ⅳ（complexⅣ,Cox Ⅳ）,磷酸酶钙神经素（pan-calcineurin A,CaN）,钙调蛋白依赖性蛋白激酶（phosphorylated（p）-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase,Camk）,P38 胞外信号调节蛋白激酶（p-p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）及细胞外信号调节激酶（p-extracellular signal-regulated kinase,Erk1/2）蛋白的表达。[结果]一、动物实验结果:（1）随着对染毒大鼠给药次数的增加和时间的延长,各个剂量组的大鼠均出现不同程度的肢体活动次数减少、反应迟钝、嗜睡、饮食摄入量减少等表现。其中低剂量组于染毒的第4d给药时发生中毒,染毒大鼠首先出现呼吸频率加快,随即开始躁动不安,步态有些蹒跚,但很快进入抑制状态,表现为俯卧不动或者侧卧,期间可出现轻度的肢体抽搐和震颤,但其中毒症状持续一段时间后仍可恢复。中剂量组和高剂量组分别于染毒的第3d和第2d出现上述的症状,症状的持续时间较低剂量组虽然有明显延长,但仍可恢复。高剂量组中则于染毒的第5d和第6d分别有一只大鼠死亡。（2）与对照组相比,各个剂量的NaN3处理组中,大鼠的SOD、GSH活性明显降低,LDH活性显着增高（P<0.01）。（3）HE结果显示:对照组纹状体神经细胞形态正常,数量多,分布均匀,神经细胞排列紧密;给药组细胞排列紊乱、疏松、形态不规则,神经元细胞胞浆呈深染,细胞核固缩,神经纤维束疏松肿胀,重者呈网眼状,神经元数量明显减少。（4）免疫组织化学染色结果显示:与对照组相比,随着染毒次数的增加和时间的延长,各个剂量组的Bax、Caspase-3及Cytochrome c阳性细胞数逐渐增加（P<0.01）,而Bcl-2的阳性细胞数逐渐减少（P<0.01）.二、体外实验结果:（1）CCK-8检测结果显示:不同给药浓度（0,5,10,20,40,80 mM）的NaN3处理PC12细胞（12-72h）后,其细胞死亡率随着给药时间的延长和给药剂量的增加而增加,在20mM浓度的NaN3处理PC12细胞24h后,PC12细胞接近半数死亡,其存活率达24.89±3.33%。实验结果提示:NaN3对PC12细胞的抑制作用呈时间和剂量的依赖性。（2）DAPI染色结果显示:不同浓度（0,10,20,40mM）的NaN3处理PC12细胞24h后,在荧光显微镜下观察发现:NaN3给药组的部分细胞核体积变小,荧光强度增强,部分细胞呈碎块状致密浓染,颜色发白,且随着给药浓度的增加,凋亡的细胞数逐渐增多,而对照组的细胞核较大,核大小及其染色均匀、染色较浅。（3）Annexin V-FITC和PI双染进一步检测细胞凋亡结果显示:（10,20,40mM）的NaN3处理PC12细胞24h后,细胞的凋亡率分别为:8.2±0.14%、43.77±10.28%、78.67±13.92%,8.20%,而对照组的凋亡率为5.03±1.38%,差异显着（P<0.05）,有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够诱导PC12细胞的凋亡,且随着给药浓度的增高,凋亡率显着增加。（4）流式细胞仪检测 mitochondrial membrane potential（△Ψm）的结果显示:（0,10,20,40mM）的NaN3处理PC12细胞24h后,其红/绿荧光的比值分别为:1.84±0.01,1.74±0.2,1.66±0.1,0.32±0.1,与对照组相比较,差别有统计学意义（P<0.05）。实验结果提示:NaN3能够降低PC12细胞中线粒体的膜电位。（5）流式细胞仪检测PC12细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平结果显示:（0,10,20,40mM）的NaN3处理PC12细胞24h后,其平均荧光强度值分别为:3.65±0.28,6.99±1.06,18.63±4.27,39.35±6.85.与对照组相比较,差异显着（P<0.01）,有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够大幅度的增加PC12细胞中的活性氧水平。（6）Luminometer 检测 PC12 细胞中 ATP 结果显示:（0,10,20,40mM）的 NaN3处理PC12细胞24h后,其细胞中的ATP含量分别为:0.21±0.02 nmol/mg,0.11±0.02 nmol/mg,0.07±0.01 nmol/mg,0.04±0.008nmol/mg.与对照组相比较,差异显着（P<0.05）,有统计学意义。实验结果提示:NaN3能够降低PC12细胞中的ATP水平。（7）Western blot结果显示:与对照组相比较,随着给药组浓度的增高,给药组中 procaspase-3,Pgc-1α,Nrf-1/2,Tfam,Cox Ⅳ,p-Erk/Erk 的表达逐步下降,而Bax/Bcl-2,cytochrome c、Pan-calcineurinA,p-Camk Ⅱ/Camk Ⅱ,p-p38MAPK/p38MAPK的表达逐步升高（P<0.05）.结论:NaN3腹腔注射能够成功复制大鼠中毒模型,并损伤大鼠模型中的纹状体形态结构,诱导纹状体神经元的凋亡;在其细胞毒性模型中证实:NaN3能够抑制PC12细胞增殖,呈浓度依赖趋势,并可诱导PC12细胞凋亡,该作用可能与其能够降低其细胞中线粒体的膜电位、ATP水平及活性氧水平的增加有关。多种因素共同作用于Pgc-1α信号通路的活化和调节可能是其分子机制之一。
Javed Iqbal[7]（2020）在《Hippocampal Gene Expression during the Estrous Cycle and Hippocampal Transcripts in Sex Difference in Animal Models of Depression》文中指出雌激素（Estrogen）在大脑中调节多种神经功能,如树突棘形成、突触可塑性、神经递质传递以及学习和记忆。海马是雌激素的主要作用靶点,在学习和记忆中起重要作用。雌激素对海马信号通路、表观遗传学和局部蛋白合成的影响主要通过细胞内雌激素受体（ERs）和膜结合的G蛋白偶联雌激素受体（GPER）介导的。神经元上的树突棘数量、大小和形状的改变与精神疾病有关。雌激素可增加海马CA1锥体神经元的树突棘密度,增强长时程增强效应（LTP）,影响雌鼠的海马依赖性的学习记忆。雌性大鼠海马神经元树突棘密度随着动情周期雌激素水平的周期变化而发生相应波动,但具体参与调控树突棘密度发生波动的关键基因仍不清楚。为此,本研究使用RNA测序（RNA-seq）方法分别检测了处于发情前期（PE,循环雌激素达到最高水平）和发情期（ES,循环雌激素达到最低水平）的SD大鼠海马转录组,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行了验证。随后为了进一步了解所检测到的与雌激素调控相关差异表达基因的功能,特使用基因本体论（GO）和《京都基因与基因组百科全书数据库》（KEGG）对其进行注释。结果发现,在差异基因表达方面,比较处于PE期和ES期的大鼠,在其海马共检测到37个差异表达基因（DEGs）（FDR校正p值（q）<0.05）。基于GO和KEGG通路分析,筛选出的这37个差异基因主要参与调节神经元突起的生长,神经再生,树突棘形成,突触形成,突触可塑性,神经保护,神经递质传递,维持正常的认知过程,增强学习记忆力,神经元抗衰老能力,少突胶质细胞成熟和髓鞘形成,介导维生素A信号传导和AKT/ERK信号传导通路。比较大鼠PE期与ES期的基因表达结果表明,处于PE期的雌性大鼠的海马在雌激素的控制下出现转录组重组,并上调配体和受体,紧密连接蛋白复合物,细胞粘附分子以及和消化吸收相关蛋白的基因表达。增强PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、神经营养蛋白信号通路等通路在PE期富集,表明这些通路中的基因表达在雌激素调控海马功能的非基因转录效应中起重要作用。而处于ES期的雌性大鼠,其海马中与免疫、信号转导、髓鞘形成和细胞发育等方面相关的基因表达水平上调,提示在低雌激素水平下这些基因的重要性。动物研究中常用卵巢切除（OVX）模型模拟女性更年期,并用外周补充雌激素的方法模拟更年期女性的雌激素替代疗法。基于上述研究结果发现正常雌性大鼠PE期和ES期的37个差异基因在参与雌激素调控海马功能中发挥着重要作用。但当外周卵巢分泌雌激素缺失时,大鼠海马又有哪些基因参与雌激素调控,以及其表达水平如何并不清楚。为此本部分研究通过对大鼠进行OVX清除外周循环雌激素,并在OVX后的不同时间点（6小时,24小时）通过颈部皮下注射的方法重新补充雌激素（10微克）以模拟PE期。使用RNA-seq进行检测基因表达,用qRT-PCR和western blot方法验证差异表达基因。结果发现,在对照组,OVX组和雌激素处理组海马中共鉴定出187个与雌激素调节相关的差异表达基因。经GO分析和KEGG分析发现,OVX引起变化的差异基因可能参与转录因子信号、脂质代谢过程、配体和受体相互作用、细胞粘附过程、细胞分化、免疫应答、生长发育等作用。OVX后补充雌激素引起变化的差异基因可能参与信号转导过程,调节神经元突起的生长,神经再生,树突棘形成,突触形成,突触可塑性,神经保护,神经递质传递,维持正常的认知功能,增强学习和记忆,增强免疫,抗衰老,神经肽信号传导和轴突髓鞘形成。此外,通过雌激素受体激动剂ERα（PPT）和ERβ（DPN）分别特异性得激活雌激素的受体ERα和ERβ而调节K1,Kcnj13,F5和Sostdcl基因的表达。雌激素和它的特异性受体激动剂可以分别激活ERα,ERβ和GPER,以调节海马中这些基因的mRNA水平。不同雌激素的受体激动剂PPT和DPN对海马mRNA水平的不同影响表明,通过使用特定的雌激素受体激动剂可以实现雌激素对这些基因表达调控的预期目的。男性与女性均可能受到抑郁情绪的影响,但女性患抑郁症的几率是男性的两倍,但其机理不详。啮齿类动物OVX后会出现抑郁样行为,而伴随OVX诱导的抑郁样行为而出现的海马基因表达的变化,可能在抑郁样行为的发生中发挥着至关重要的作用。在海马,应激相关基因的表达对不同慢性应激抑郁模型反应的性别差异并不太清楚,并且到底哪种抑郁动物模型可以更好的模拟抑郁症的性别差异也不太清楚。为此,本部分研究分别比较了亚慢性可变应激（SCVS）与慢性不可预见性温和应激（CUMS）抑郁模型对雌性和雄性SD大鼠的影响,从而评估这两种应激抑郁模型诱导雄性和雌性大鼠出现抑郁样行为的性别差异以及效率。并通过qRT-PCR方法,比较在这两种抑郁模型中,在PE组和ES组、OVX组和OVX+雌激素组实验中选择出的的基因（Htr7、Egr2、HDAC2、Robo2、Sgk2、Otx2、Pth2r和Npas4）的mRNA水平。实验结果表明,SCVS仅仅诱导雌性大鼠出现抑郁样行为,而CUMS仅仅诱导雄性大鼠出现抑郁样行。SCVS仅对雌性海马Npas4、Otx2、Robo2、Pth2r、Sgk2和雄性海马HDAC2的mRNA水平有显着影响。与SCVS相比,CUMS显着改变了雌性海马一个基因（Robo2）的mRNA水平。本研究首次证明,在研究抑郁行为性别差异的发生中,与CUMS模型相比,SCVS模型可能是更合适的模型,并且SCVS诱导的雌性大鼠的抑郁样行为可能与上述基因的转录激活有关。此结果将有助于在未来的研究中解释抑郁症性别差异的机理。
田丹枫[8]（2020）在《参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究》文中研究指明血管性痴呆（Vascular Dementia,VD）是痴呆常见类型之一,以记忆力进行性衰退、认知功能障碍及性格、情感等精神改变为主要临床表现。VD的病理机制与兴奋性氨基酸毒性损伤、突触可塑性改变、钙超载、氧化应激损伤及细胞凋亡等过程密切相关,早预防、早发现、早治疗可显着提高VD患者的生存率及生活质量,降低死亡率。课题组基于VD的“毒损脑络”中医创新病因病机理论并结合多年临床经验,创制了具有解毒通络作用的参知健脑方。前期动物体内实验研究表明,本方可改善VD大鼠的认知功能,修复受损海马神经元,通过调控谷氨酸突触囊泡转运关键蛋白clathrin介导的NMDA受体内吞过程,减轻谷氨酸所致神经兴奋性毒性而起到神经保护作用。但研究大多仅从单个靶点或通路评估参知健脑方对VD的干预作用,并未完全解释其药效机制;且目前尚未对其进行体外细胞实验深入分析验证,其分子机制值得更深入地探索研究。目的:基于VD“毒损脑络”理论,（1）通过网络药理学探讨参知健脑方治疗VD的药理作用及分子机制;（2）通过体外实验,筛选干预药物的适宜浓度,并探讨参知健脑方对拟VD细胞模型增殖及毒性的影响;（3）研究参知健脑方对拟VD细胞模型周期、凋亡及细胞内游离Ca2+和ROS/Superoxide水平的影响,探讨其对VD细胞模型谷氨酸兴奋性毒性的神经保护作用,并验证参知健脑方的治疗有效性及网络药理学结果的可靠性;（4）研究参知健脑方对拟VD细胞模型clathrin、RAB5B和NMDAR1表达水平的影响,探讨其是否通过调控clathrin介导的NMDA受体内吞过程发挥对VD的治疗作用,并验证网络药理学结果的可靠性。方法:第一部分:依托多种数据库检索并收集参知健脑方的入血化学成分、作用靶点和VD作用靶点,随后整合数据获得参知健脑方治病靶点。通过Cytoscape3.7.1构建参知健脑方-活性化合物-治病靶点网络图,STRING数据库构建蛋白互作网络,DAVID数据库进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。第二部分:采用谷氨酸诱导PC12细胞损伤作为VD细胞模型,采用CCK-8法和IncuCyte动态细胞成像技术筛选出谷氨酸适宜造模剂量及参知健脑方低、中、高干预剂量。参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型,观察其对细胞形态、细胞增殖及毒性的作用。第三部分:采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤作为VD细胞模型,参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型,采用流式细胞术等技术观察其对细胞周期、凋亡、细胞内游离Ca2+、活性氧和超氧化物（ROS/Superoxide）水平的影响,qRT-PCR检测caspase-3 mRNA的相对表达水平。第四部分:采用谷氨酸诱导的PC12细胞损伤作为VD细胞模型,参知健脑方各剂量与盐酸美金刚分别干预VD细胞模型。采用免疫荧光和Western blot技术分别检测clathrin、RAB5B和NMDAR1的分布和蛋白表达水平;qRT-PCR技术检测clathrin和NMDAR1在mRNA水平上的表达情况。结果:第一部分:网络药理学研究结果表明,（1）参知健脑方-活性化合物-治病靶点网络图包含3个单味药,18个活性化合物,154个治病靶点。其中,芍药苷、白芍苷和新芒果苷等活性成分关联基因较多,FGF1和FGF2位列治病靶点首位。（2）PPI网络包含154个靶点蛋白,关键蛋白涉及INS、ALB、AKT1、CASP3、JUN、PTGS2等。（3）GO富集分析共有条目4960个,其中生物过程相关条目4176个,细胞组成相关条目306个,分子功能相关条目478个。（4）KEGG富集分析共有相关通路30条,涉及MAPK信号通路、HIF-1信号通路、凋亡通路、神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路等。第二部分:体外实验结果表明,（1）药物干预剂量筛选:谷氨酸适宜造模剂量为22.5 mM,参知健脑方低、中、高剂量分别为:0.05、0.1、0.2 mg/mL,盐酸美金刚干预剂量为10 μM。（2）细胞形态学:正常PC12细胞呈不规则长梭形,形态完整,突起明显,贴壁牢固;谷氨酸处理的PC12细胞呈圆球形,结构不完整,胞体皱缩,易聚集成团;突起变短或减少、消失,细胞贴壁不牢;随着时间的增加,死细胞数明显增多,细胞死亡率显着上升。与模型组相比,参知健脑方各剂量组细胞胞体均相对完整,部分细胞突起少量存在,存在突触间联系;细胞贴壁较模型组牢固;随着时间的增加,死细胞数增多不明显,细胞死亡率没有显着上升。盐酸美金刚组细胞形态较模型组略有改善。（3）CCK-8增殖实验:谷氨酸可以显着降低PC12细胞活力,抑制细胞增殖（P<0.05）;参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可明显提高PC12细胞活力,促进细胞增殖,降低细胞毒性（P<0.01）。（4）IncuCyte增殖实验:谷氨酸可以持续增加细胞绿色荧光面积和死细胞数,死亡率呈明显上升趋势,细胞融合率持续下降;参知健脑方各剂量均可以有效减少细胞绿色荧光面积和死细胞数,死亡率降低,融合率呈上升趋势;盐酸美金刚的各项结果趋势与谷氨酸类似。（5）CFSE增殖实验:谷氨酸可以明显增高CFSE平均荧光强度（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚CFSE平均荧光强度均呈减弱趋势,但差异无显着统计学意义（P>0.05）。第三部分:体外实验结果表明,（1）细胞周期:谷氨酸可以显着增加S期细胞比例,使细胞阻滞在S期（P<0.01）;参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可以显着降低S期细胞比例（P<0.01）。（2）细胞凋亡:谷氨酸可以明显增加凋亡率（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可以显着减少细胞凋亡（P<0.01）。（3）Ca2+和ROS/Superoxide水平:谷氨酸可明显升高细胞内Ca2+和ROS/Superoxide水平（P<0.01）,参知健脑方各剂量和盐酸美金刚均可不同程度降低细胞内Ca2+和ROS水平（P<0.05,P<0.01）。（4）qRT-PCR:谷氨酸可以明显增加caspase-3 mRNA的表达水平（P<0.01）;参知健脑方和盐酸美金刚均可显着降低caspase-3 mRNA的表达水平（P<0.01）。第四部分:体外实验结果表明,（1）免疫荧光:clathrin主要表达于细胞膜和细胞质;RAB5B主要表达于细胞膜和细胞质中的早期内体;NMDAR1主要表达于细胞膜和突触。谷氨酸显着降低clathrin和RAB5B的表达（P<0.01,P<0.01）,增加NMDAR1的水平（P<0.01）;参知健脑方各剂量均可上调clathrin、RAB5B水平（P<0.05,P<0.05）,下调NMDAR1水平（P<0.05）。（2）qRT-PCR:谷氨酸可明显降低clathrin mRNA的表达（P<0.01）,并增加NMDAR1 mRNA的表达水平（P<0.01）;参知健脑方可明显增加clathrin的表达并显着降低NMDAR1的表达水平（P<0.01）。（3）Western Blot:谷氨酸可抑制clathrin和RAB5B的表达,明显增加NMDAR1的表达水平（P<0.01）;参知健脑方各剂量均可以显着上调clathrin、RAB5B表达水平,下调NMDAR1 的水平（P<0.01）。结论:（1）参知健脑方治疗VD的作用靶点和通路机制呈现多角度、多途径、多环节的特点,其治病靶点大多与血管、神经保护及突触可塑性调节相关,且靶点与通路之间相互协同发挥作用,提示这可能是参知健脑方治疗VD的关键,为深入研究参知健脑方治疗VD的其他机制提供了新思路。（2）适宜浓度的谷氨酸可以显着促进PC12细胞增殖,但谷氨酸浓度过高会产生细胞毒性,导致细胞死亡。参知健脑方各剂量能均能明显促进细胞增殖,提高细胞活力及细胞融合率,减少死细胞数目及死亡率,减少细胞毒性损伤;均对细胞形态有一定修复作用,改善细胞贴壁不牢的状态。（3）参知健脑方能有效修复细胞周期循环,下调caspase-3的表达而减少细胞凋亡;降低细胞内Ca2+浓度而阻止Ca2+内流并增强细胞清除ROS和Superoxide的能力,减少谷氨酸毒性积累及氧化应激损伤。参知健脑方可影响上述多种途径发挥神经保护作用;验证了参知健脑方治疗VD的有效性以及网络药理学计算机预测结果的可靠性。（4）Clathrin介导的NMDA受体胞吞障碍导致谷氨酸兴奋性毒性积累,“解毒通络”的参知健脑方可改善谷氨酸损伤PC12细胞clathrin介导的NMDA受体胞吞过程而降低谷氨酸神经兴奋性毒性。其发挥神经保护的作用机制可能与上调clarhrin和RAB5B的表达,促进clathrin介导的NMDA受体胞吞过程有关。验证了参知健脑方治疗VD的有效性以及网络药理学研究结果的可靠性,为“解毒通络”法则治疗VD提供了微观证据。
刘殿玮[9]（2020）在《BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制》文中研究表明背景:认知功能是大脑的高级神经活动之一,是人类和动物获得或应用知识以及信息加工的过程,它包括精神和智力活动的各个方面,学习和记忆是其中最主要的方面。学习记忆是一个由各种神经细胞、神经突触之间相互作用、相互联系形成的复杂的大脑高级活动过程。研究学习记忆的分子机制尤其是疾病导致的学习记忆障碍的机制,将为治疗记忆类疾病和疾病导致的认知能力降低提供新靶点、新思路。条件性味觉厌恶（conditioned taste aversion,CTA）是将味觉刺激与内脏不适感觉相关联的学习过程,是研究学习记忆的经典的条件反射。动物在饮用某种有特殊味觉特征的食物后,随后出现恶心、呕吐、腹泻等内脏不适,当再次遇到相同味觉特征的食物时,便会减少或拒绝摄取该食物。条件反射建立后,动物会长时间记住该食物的特殊味觉特征,因此CTA可以用来研究记忆的一个重要过程:记忆消退（extinction）。由于很多疾病,如脑卒中,可导致创伤后应激综合征（post traumatic stress disorder,PTSD）,而记忆消退与此密切相关,因此研究记忆消退的分子机制将有助于记忆相关疾病的诊治。另外,研究表明丘脑、杏仁体、岛叶（Insular cortex,IC）等脑区与CTA密切相关,因此,便于在解剖学基础上进一步研究学习记忆的分子机制。脑卒中是因各种诱发因素引起内动脉狭窄、闭塞或出血而造成的急性脑血液循环障碍,是当前威胁人类生命的三大疾病之一。脑卒中按发病原因可分为出血性和缺血性,其中缺血性脑卒中约占全部卒中的80%,且每年以8.1%的速率不断上升。在我国,70%-80%的缺血性脑卒中患者遗留有不同程度的躯体运动及认知功能障碍,其中认知功能障碍常常干扰患者对外界环境的感知和适应,给患者家庭和社会带来了严重的负担。目前关于缺血性脑卒中后的认知功能,尤其是学习记忆障碍未受到足够重视。学习记忆障碍不仅严重影响患者的日常生活能力,也对躯体感觉运动功能的恢复造成不利影响,是缺血性脑卒中致残的重要原因之一。因此研究缺血性脑卒中后学习记忆障碍的分子机制,及早发现并有效治疗具有重要的医学价值和社会意义。脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）是中枢神经系统中含量最丰富、分布范围最广的神经营养素家族成员,且在与认知功能密切相关的脑区如海马、皮层、纹状体等表达较高。BDNF不仅对神经元的存活、分化、生长和损伤修复具有重要作用,还参与学习记忆等多种生物学功能。随着脑损伤修复机制研究的不断深入,证据表明神经可塑性是脑卒中功能恢复的基础。而BDNF对神经元可塑性起着重要的调控作用,BDNF合成后通常储存在突触的致密核心囊泡（dense core vesicle,DCV）中,它必须从中分泌释放,并与其高亲和力酪氨酸激酶受体B（TrkB）结合使其磷酸化,继而激活mitogen activated protein kinase（MAPK）、phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）和phospholipase Cγ（PLC-γ）等一系列胞内信号转导通路,才能最终发挥其生物学功能。但是目前BDNF分泌的机制仍不明确。因此,研究BDNF分泌在学习记忆中的作用,寻找缺血性脑卒中后BDNF分泌的调控分子,明确其在缺血性脑卒中记忆障碍中的作用机制,将有助于进一步了解学习记忆的分子生物学机制,并有望成为缺血性脑卒中记忆障碍的重要治疗手段。综上所述,本课题采用CTA动物行为学和大鼠大脑中动脉线栓模型,应用Elisa、western-blot、实时荧光定量PCR、原位杂交、腺相关病毒、水迷宫等方法,系统的研究了 BDNF分泌在CTA记忆消退以及缺血性脑卒中后学习记忆障碍中的作用及其机制。通过本项研究,能够使我们进一步了解BDNF参与学习记忆的神经生物学机制,更为将来以BDNF及其调控分子为目标的缺血性脑卒中记忆障碍的诊疗提供新思路和新方法。研究目的:1.探讨岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。研究方法:1.脑内埋管将麻醉后的雄性Wistar大鼠头部固定于脑立体定位仪,以前囟点为原点,参考大鼠脑立体定位图谱,双侧脑内埋管至岛叶上lmm,术后一周开始后续实验。CTA消退测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF中和抗体,连续注射三天,观察动物行为学的变化。2.条件性味觉厌恶CTA记忆消退大鼠限水24小时后,每天上午定时喂水,适应3天,大鼠便会形成固定时间饮水的习惯。第4天,给予大鼠等量糖水,饮后40分钟腹腔注射氯化锂（LiCl）,造成动物腹部不适,从而建立条件反射。3天后开始进行消退测试,测试时同时给予大鼠糖水和自来水,但不给予腹腔注射LiCl,分别记录动物饮自来水和糖水的量,计算饮自来水占饮液体总量的百分比,该比值称为厌恶指数。连续测试4天,随着测试天数的增加,厌恶指数逐渐降低,说明动物经过训练后记忆逐渐消退。3.缺血性脑卒中模型的建立雄性大鼠麻醉后,于颈部正中切口,逐层分离并暴露颈部血管,从颈外动脉或颈总动脉分叉部插入线栓,进入颈内动脉,阻断左侧大脑中动脉（middle cerebral artery,MCA）起始段及其所有血液供应,导致MCA局灶性缺血,缝合皮肤,留一线端在外,2小时后小心抽出线栓。假手术组只钝性分离颈总动脉,然后逐层缝合。4.实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）在CTA记忆消退和缺血性脑卒中术后,选定不同的时间点,取大鼠岛叶或海马,用RNA提取试剂盒提取RNA。取定量总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。最后根据目的基因的不同,选择不同的退火温度做实时定量PCR,检测目的基因的变化情况。5.BDNF Elisa在CTA记忆消退和缺血性脑卒中后特定时间点,取大鼠特定脑组织,提取蛋白后测定蛋白浓度。将标准品倍比稀释。取出板条,依次向每孔中加入分析液,标准品和待测样本,样本和标准品设置复孔,室温避光孵育2小时。振荡洗后,孵育二抗。再次洗涤后,加入底物工作液孵育显色,最后终止反应。6.原位杂交CTA消退第2天测试完毕后,在特定的时间点将大鼠麻醉后进行心脏灌流,取出脑组织后固定过夜后,置于蔗糖中沉淀直至沉至管底,冰冻切片机进行切片,切片厚度为40μm,每只动物留取6套组织切片进行原位杂交实验检测BDNFmRNA,最后用Image J软件统计各组岛叶的灰度值。7.免疫沉淀CTA记忆消退第二天测试完毕后不同时间点,于冰上取岛叶并用蛋白裂解液提取蛋白。取定量蛋白裂解液,向其中加入蛋白A微球润洗后,加入TrkB抗体,于4℃孵育3-4小时,向其中加入蛋白A微球,4℃孵育过夜,收集微球,经蛋白变性、电泳、转膜等步骤将蛋白转至PVDF膜,PVDF膜封闭结束后,分别孵育pY99磷酸化酪氨酸抗体及TrkB抗体检测磷酸化TrkB及总TrkB,根据两者的比值判断各组磷酸化TrkB的变化。8.Western blotCTA消退第二天测试完毕后或MCAO术后第一天及第三天取脑,加入蛋白裂解液研磨后提取蛋白,加上样缓冲液煮沸后将蛋白变性。经电泳、转膜及封闭后,分别加入 c-Fos、Erk、磷酸化 Erk、caspase-3、CAPS1、LC3B、TrkB、磷酸化TrkB、Akt及磷酸化Akt等抗体,4℃孵育过夜,回收一抗后,加入相应二抗室温孵育1小时,最后ECL显影。9.免疫组化缺血性脑卒中术后第一天及第三天,将大鼠麻醉,灌流取脑,冰冻切片机切片,切片厚度为20 μm,进行免疫荧光染色。切片经5%山羊血清封闭1小时后,滴加CAPS1及secretogranin I（突触致密囊泡DCV的蛋白标志物）的一抗,4℃孵育过夜,回收一抗后,滴加荧光二抗。最后用DAPI孵育5分钟,显微镜下观察CAPS 1与DCV共定位的情况。l0.Morris水迷宫水迷宫实验是测试缺血性脑卒中后学习记忆的常用实验。大鼠脑卒中术后恢复一周,第8天开始进行水迷宫实验。摄像机记录大鼠运动轨迹。定位航行实验:将大鼠依次从四个象限放入水中,记录大鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间,即逃避潜伏期,时间越短说明学习记忆能力越强,连续训练5天。空间探索实验:第13天撤去平台,记录大鼠60秒内在原平台象限的活动时间,以评判大鼠的空间记忆。结果:1.岛叶BDNF分泌在CTA记忆消退中的作用及其机制1.1.岛叶BDNF参与CTA记忆消退过程为了明确岛叶中BDNF在记忆消退中的作用,我们选择在CTA消退第1、2、3天测试完毕后立即在岛叶内微量注射BDNF抗体,用厌恶指数评价记忆消退的情况,厌恶指数越高消退越慢,说明大鼠学习能力越差;为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退能否诱导岛叶中神经元活化,我们用western blot检测了消退第二天测试完毕后90min岛叶中c-Fos的变化,结果显示:在岛叶中注射BDNF抗体后,从消退第二天开始,厌恶指数明显高于溶剂对照组,说明注射BDNF抗体能够阻断条件性味觉厌恶记忆消退过程;消退第二天测试完毕后90min,c-Fos表达量升高,说明岛叶中BDNF参与条件性味觉厌恶记忆消退过程,且条件性味觉厌恶记忆消退能够激活岛叶中神经元。为了进一步明确条件性味觉厌恶记忆消退后岛叶中BDNF的变化,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取岛叶,分别用实时荧光定量PCR及BDNF Elisa检测了 BDNF mRNA及蛋白的变化情况。结果显示:CTA消退第二天岛叶中BDNF基因及蛋白表达量均出现不同程度的升高,而NGF和NT-4mRNA的表达水平没有明显变化,说明CTA消退特异性的诱导岛叶中BDNF出现时间特异性表达增加。另外,为了更直观的显示BDNFmRNA的变化,我们进一步用原位杂交验证了 Real-time PCR的结果。这些结果提示:CTA记忆消退诱导岛叶中BDNF表达升高,且BDNF的变化参与CTA记忆消退过程。1.2.CTA记忆消退诱导岛叶中活性依赖的BDNF分泌BDNF分泌释放后与TrkB受体结合并使其磷酸化,所以磷酸化TrkB的水平能够反映BDNF分泌的情况。为了进一步明确CTA消退能否诱导活性依赖的BDNF分泌,我们选择BDNF表达变化前以及BDNF升高的时间点,取岛叶脑组织,用免疫沉淀检测磷酸化TrkB,结果显示:在BDNF蛋白升高的时间点,岛叶中磷酸化TrkB水平升高,说明此时TrkB的磷酸化是由于BDNF蛋白合成后释放导致的。有趣的是,我们发现在BDNF升高前,磷酸化TrkB水平已经升高,说明在BDNF蛋白升高前,CTA记忆消退诱导了 BDNF分泌。为了进一步证实CTA消退诱导岛叶中BDNF分泌,我们用western blot检测了 BDNF下游分子Erk及其磷酸化情况,结果显示:与磷酸化TrkB变化一致,CTA消退第二天岛叶中磷酸化Erk升高,进一步证实BDNF分泌通过Erk信号通路参与CTA记忆消退过程。1.3.CTA记忆消退抑制神经元凋亡为了明确记忆消退过程中脑细胞凋亡的情况,我们选择在条件性味觉厌恶记忆消退第二天测试完毕后不同时间点取脑,用western blot检测了凋亡相关分子caspase-3的变化,结果显示:CTA消退后caspase-3表达量降低,说明CTA记忆消退抑制岛叶中神经元的凋亡。文献报道,BDNF能够抑制神经元凋亡,因此我们的结果进一步提示岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。2.探讨BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中学习记忆障碍中的作用及其机制。2.1缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加本课题采用大鼠左侧大脑中动脉阻塞线栓法制备缺血性脑卒中模型,术后1天,3天及7天取双侧海马,分别用Real-time PCR及Elisa检测BDNFmRNA及BDNF蛋白的变化,另外,用western blot检测BDNF受体p-TrkB及其下游分子p-Akt的变化情况。结果显示:与假手术组相比,双侧海马中BDNFmRNA及蛋白在术后1天及3天均出现了不同程度的升高,且在BDNF变化的时间点p-TrkB及p-Akt均出现了不同程度的升高,说明缺血性脑卒中诱导海马中BDNF分泌增加,且BDNF/TrkB/Akt信号通路可能在缺血性脑卒中预后中起着重要的调控作用。2.2缺血性脑卒中诱导海马CAPS1表达增加BDNF分泌是钙离子依赖的过程。体外研究表明,钙离子依赖分泌激活蛋白 1（Ca2+-dependent activator protein for secretion 1,CAPS1）在其中起着重要的调控作用。为了明确CAPS1是否参与调控缺血性脑卒中后BDNF分泌,我们在大鼠缺血性脑卒中术后BDNF升高的时间点取双侧海马,用western blot检测CAPS1的变化,结果显示:在BDNF及磷酸化TrkB升高的时间点,双侧海马中CAPS1表达升高,说明海马中CAPS1可能参与调控缺血性脑卒中后BDNF的分泌。2.3缺血性脑卒中后海马中CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌合成的BDNF储存于突触致密囊泡DCV中,为了进一步明确CAPS1调控BDNF分泌的机制,我们用免疫组化检测了缺血性脑卒中术后第1天及第3天海马中CAPS1与DCV共定位的情况。结果显示:与假手术组相比,脑卒中术后第1天及第3天,海马CAPS1与DCV共定位增强,提示CAPS1通过与DCV结合进而调控BDNF分泌。2.4海马CAPS1调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆障碍的恢复为了明确CAPS1是否通过调控BDNF分泌,进而参与缺血性脑卒中记忆障碍的调控,我们设计了 CAPS1腺相关病毒,大鼠海马内微量注射腺相关病毒1个月后建立缺血性脑卒中（MCAO）模型,MCAO术后恢复一周,术后第8天开始用水迷宫检测CAPS1在缺血性脑卒中记忆障碍的作用。我们首先用western blot检测了 CAPS1腺相关病毒对CAPS1及p-TrkB的影响,结果显示:与假手术组相比,注射病毒空载体（对照腺相关病毒）组在MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB表达显着升高,说明注射对照腺相关病毒对CAPS1的表达没有影响。与注射对照腺相关病毒相比,注射CAPS1腺相关病毒导致MCAO术后第1天和第3天海马中CAPS1及p-TrkB的表达降低,且与假手术组没有差异,说明CAPS1腺相关病毒能够抑制缺血性脑卒中诱导的CAPS1表达及BDNF分泌。进一步应用水迷宫实验证实,缺血性脑卒中大鼠逃避潜伏期延长,说明空间学习记忆受损,但随着训练次数的增加,脑卒中大鼠的学习记忆能力逐渐恢复至正常水平;而海马内注射CAPS1腺相关病毒的脑卒中大鼠,记忆损伤不能恢复。这些结果表明,海马CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中后学习记忆损伤的恢复。结论:1.CTA记忆消退特异性诱导岛叶BDNF分泌及表达增加,且岛叶BDNF分泌参与CTA消退过程。2.岛叶中BDNF通过抑制神经元凋亡参与CTA记忆消退。3.缺血性脑卒中诱导海马中BDNF表达及分泌增加,分泌的BDNF通过与其受体TrkB结合进而激活下游Akt信号通路。4.缺血性脑卒中诱导海马中CAPS1表达增加,且CAPS1通过与突触致密囊泡结合调控BDNF分泌。5.CAPS1通过调控BDNF分泌参与缺血性脑卒中学习记忆损伤的恢复。意义:本课题研究了 BDNF分泌在记忆消退中的作用及其机制,并首次证实缺血性脑卒中能够诱导海马中BDNF分泌增加,且CAPS 1能够通过调控BDNF分泌参与脑卒中记忆损伤恢复的调控。这将使我们进一步明确BDNF及其调控分子在记忆相关疾病中的作用;并为缺血性脑卒中后认知功能障碍的治疗提供新的思路和新靶点。
陈华丽[10]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中指出哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
二、Experimental Study of Effect of Corticosterone on Primary Cultured Hippocampal Neurons and Their Ca~(2+) /CaMKⅡ Expression（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Experimental Study of Effect of Corticosterone on Primary Cultured Hippocampal Neurons and Their Ca~(2+) /CaMKⅡ Expression（论文提纲范文）
（1）Establishment of injury models in studies of biological effects induced by microwave radiation（论文提纲范文）
| Background |
| Microwave exposure conditions |
| Subjects used to establish injury models |
| Animal species |
| Rats |
| Mice |
| Rabbits |
| Monkeys |
| Other animal species |
| Cell types |
| Neurons |
| Germ cells |
| Heart cells |
| Other organisms |
| Methods for the as sessment of microwave radiation injuries |
| Methods for the evaluation of functional injuries Brain function injuries |
| Reproductive function injuries |
| Cardiac function injuries |
| Endocrine organ function injuries |
| Methods for the evaluation of structural injuries |
| Microstructural injuries |
| Ultramicrostructural injuries |
| Methods for the investigation of the biological mechanisms of microwave exposure injuries |
| Apoptosis and abnormal proliferation |
| Cell membrane damage |
| Changes in proteins |
| Changes in genes and gene expression |
| Changes in oxidative stress parameters |
| Changes in neurotransmitters |
| Indicators of microwave radiation-induced biological injuries |
| Indicators of functional injuries |
| Indicators of reproductive function injuries |
| Indicators of cardiac function injuries |
| Indicators of endocrine organ function injuries |
| Indicators of structural injuries |
| Indicators for investigations of the mechanism of biological injury |
| Neurotransmitters |
| Metabolic indicators |
| Stress-related indicators |
| Cell proliferation-and cell death-related indicators |
| Indicators-related to cell membrane damage |
| Signal transduction-related indicators |
| Genotoxicity-related indicators |
| Discussion |
| Conclusion |
| Abbreviations |
| Acknowledgments |
| Authors’contributions |
| Availability of data and materials |
| Ethics approval and consent to participate |
| Consent for publication |
| Competing interests |
（2）基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 抑郁症现代医学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抑郁症中医药研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 1. 抑郁症病理机制中的线粒体损伤 |
| 2. 线粒体能量代谢障碍与突触可塑性损伤 |
| 3. 线粒体生物合成异常与抑郁症神经元突触重塑 |
| 4. 从“脾”论治抑郁症或成为中医治疗的新途径 |
| 参考文献 |
| 实验一 醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁大鼠行为学及海马神经元损伤的保护作用研究 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α介导的线粒体生物合成研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨醒脾解郁方含药血清对皮质酮诱导海马神经元损伤突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨突触微环境对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响及醒脾解郁方干预效应 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、初步结论 |
| 三、存在不足 |
| 四、创新点 |
| 五、展望 |
| 第四部分 附录 |
| 附录1: 致谢 |
| 附录2 攻读学位期间发表的学术论文及参与课题情况 |
| 附录3 个人简历 |
（3）猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猴头菌概述 |
| 1.1.1 猴头菌研究进展及开发现状 |
| 1.1.2 猴头菌的活性成分研究 |
| 1.2 多糖的研究概述 |
| 1.2.1 多糖的特性及应用 |
| 1.2.2 多糖的生物学活性研究进展 |
| 1.3 阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)概述 |
| 1.3.1 AD研究现状 |
| 1.3.2 AD发生发展的机制研究进展 |
| 1.3.3 AD当下的治疗策略 |
| 1.4 立题背景与研究意义 |
| 第2章 猴头菌液体深层发酵工艺优化及发酵菌丝体活性成分分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器和材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验菌种 |
| 2.2.3 实验试剂及培养基 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌种培养方案 |
| 2.3.2 满意度函数的建立 |
| 2.3.3 猴头菌发酵菌丝体干重及胞内多糖含量测定 |
| 2.3.4 猴头菌发酵培养基优化 |
| 2.3.5 猴头菌发酵条件优化 |
| 2.3.6 猴头菌液体深层发酵工艺产量验证 |
| 2.3.7 猴头菌发酵菌丝体活性成分分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 碳源种类对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.2 氮源对猴头菌发酵的影响 |
| 2.4.3 无机盐种类对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.4 P-B实验结果与分析 |
| 2.4.5 CCD结果与分析 |
| 2.4.6 不同温度对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.7 不同转速对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.8 培养基初始p H对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.9 接种量对猴头菌发酵期望值的影响 |
| 2.4.10 猴头菌液体深层发酵周期确定及生长曲线的绘制 |
| 2.4.11 猴头菌液体深层发酵工艺产量验证结果 |
| 2.4.12 猴头菌发酵菌丝体中活性成分分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 猴头菌发酵菌丝体水提物抗AD活性初步研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器和材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验菌种、细胞系和动物 |
| 3.2.3 实验试剂和培养基 |
| 3.2.4 试剂盒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HE的制备 |
| 3.3.2 PC12 细胞培养方法 |
| 3.3.3 HE对细胞形态的影响 |
| 3.3.4 MTT法评估细胞活力 |
| 3.3.5 细胞凋亡核变化评估 |
| 3.3.6 MMP评估 |
| 3.3.7 细胞内Ca~(2+)浓度分析 |
| 3.3.8 细胞内ROS水平分析 |
| 3.3.9 Western Blotting分析 |
| 3.3.10 AD小鼠模型建立和药物治疗 |
| 3.3.11 AD小鼠行为学观察 |
| 3.3.12 小鼠解剖和样品收集 |
| 3.3.13 ELISA检测 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 HE通过调节β-tubulin III对 PC12 细胞分化的诱导作用 |
| 3.4.2 HE对DPC12 细胞活力的影响 |
| 3.4.3 HE对DPC12 细胞凋亡核变化的影响 |
| 3.4.4 HE对DPC12 细胞线粒体功能障碍的改善作用 |
| 3.4.5 HE对 DPC12 细胞中Ca~(2+)超载的改善作用 |
| 3.4.6 HE对 DPC12 细胞ROS积累的改善作用 |
| 3.4.7 HE对AD小鼠体重的影响 |
| 3.4.8 HE对AD小鼠行为学的影响 |
| 3.4.9 HE对 AD小鼠下丘脑和血清中ACh和 Ch AT浓度的调节作用 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 猴头菌发酵菌丝体胞内多糖的纯化、理化分析和结构研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器和材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验菌种和细胞系 |
| 4.2.3 实验试剂和培养基 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 HT22 细胞的培养 |
| 4.3.2 猴头菌发酵菌丝体活性粗多糖的制备 |
| 4.3.3 活性粗多糖的纯化 |
| 4.3.4 总糖和总蛋白含量测定 |
| 4.3.5 紫外光谱分析 |
| 4.3.6 单糖组成分析 |
| 4.3.7 分子量和均一性分析 |
| 4.3.8 红外光谱分析 |
| 4.3.9 多糖键合结构分析 |
| 4.3.10 多糖核磁解析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 猴头菌活性纯化多糖PHEB的制备 |
| 4.4.2 PHEB中总糖和总蛋白含量检测结果 |
| 4.4.3 PHEB紫外光谱分析结果 |
| 4.4.4 PHEB单糖组成分析结果 |
| 4.4.5 PHEB分子量和均一性分析结果 |
| 4.4.6 PHEB红外光谱分析结果 |
| 4.4.7 PHEB键合结构分析结果 |
| 4.4.8 PHEB的结构鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 猴头菌纯化多糖基于氧化应激介导的Ca~(2+)平衡调节在辅助治疗AD作用中的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器和材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 试剂盒 |
| 5.2.5 实验抗体 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 APP/PS1 小鼠饲养及分组给药 |
| 5.3.2 小鼠行为学考察 |
| 5.3.3 小鼠解剖和样品收集 |
| 5.3.4 苏木精/伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色 |
| 5.3.5 IHC分析 |
| 5.3.6 ELISA检测 |
| 5.3.7 蛋白质组学分析 |
| 5.3.8 Western Blotting分析 |
| 5.3.9 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 PHEB给药对APP/PS1 小鼠体重的影响 |
| 5.4.2 PHEB对 APP/PS1 小鼠不同器官的病理学的影响 |
| 5.4.3 PHEB对 APP/PS1 小鼠行为学的影响 |
| 5.4.4 PHEB对 APP/PS1 小鼠胆碱能因子的调节作用 |
| 5.4.5 PHEB对 APP/PS1 小鼠海马和血清中Aβ_(1-42)表达的清除作用 |
| 5.4.6 PHEB对 APP/PS1 小鼠海马中tau的磷酸化表达的调节作用 |
| 5.4.7 PHEB基于Nrf2 途径对APP/PS1 小鼠氧化应激的调节作用 |
| 5.4.8 LFQ蛋白质组学分析 |
| 5.4.9 PHEB基于对Ca~(2+)平衡的调节发挥抗AD作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 实验结论 |
| 6.2 前景展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（4）Functional repertoire of protein kinases and phosphatases in synaptic plasticity and associated neurological disorders（论文提纲范文）
| Introduction |
| Search Strategy and Selection Criteria |
| Data retrieval |
| Inclusion criteria |
| Exclusion criteria |
| Role of Protein Kinases and Protein Phosphatases in Long-Term Potentiation and Long-Term Depression |
| Regulation of Postsynaptic Protein Kinases and Structural Plasticity |
| Ca2+/CaMKII |
| c AMP-dependent protein kinase A |
| Ca2+/phospholipid-dependent protein kinase C |
| Myosin kinases |
| Rho kinases (Rac,RhoA,and Cdc42),and p21 activated kinases |
| Regulation of Postsynaptic Protein Phosphatases and Structural Plasticity |
| Protein phosphatase 1 |
| Protein phosphatase 2A |
| Protein phosphatase 2B–calcineurin |
| Activity-Dependent Structural Plasticity and Associated Neurological Disorders |
| Concluding Remarks and Future Directions |
（5）复方柴金解郁片通过改善海马神经元突触功能发挥抗抑郁作用（英文）（论文提纲范文）
| 1 Introduction |
| 2 Materials and Methods |
| 2.1 In vitro experiments |
| 2.1.1 Experimental animals |
| 2.1.2 Drugs and main reagents |
| 2.1.3 Preparation of drug containing serum |
| 2.1.4 Primary culture of neurons |
| 2.1.5 Model building |
| 2.1.6 Detection of intracellular calcium level |
| 2.1.7 mEPSC record |
| 2.1.8 Detection of the expression levels of synaptic plasticity related protein |
| 2.1.9 Detection |
| 2.2 In vivo experiments |
| 2.2.1 Experimental animals |
| 2.2.2 Drugs and main reagents |
| 2.2.3 Drug administration |
| 2.2.4 Behavioral |
| 2.2.5 Sample collection |
| 2.2.6 Plasma CORT concentrations |
| 2.2.7 Golgi-Cox staining |
| 2.3 Statistical analysis |
| 3 Results |
| 3.1 In vitro experiment results |
| 3.1.1 Effects of CJJYT on hippocampal neuronsintracellular Ca2+levels |
| 3.1.2 Effects of CJJYTon hippocampal neuronsm EPSC amplitude and frequency |
| 3.1.3 Effectsof CJJYT on hippocampal synapticplasticity-related proteins |
| 3.1.4 Effectsof CJJYT on hippocampal synapticplasticity-related protein’s genes m RNA |
| 3.2 In vivo experiment results |
| 3.2.1 Effects of CJJYT on depression-like behaviors in depression model rats |
| 3.2.2 Effectsof CJJYT on cognitive function ofdepression model rats |
| 3.2.3 Effects of CJJYT on the expression level of CORT in depression model rats |
| 3.2.4 Effects of CJJYT on the expression level of CORT in depression model rats |
| 4 Discussion |
| 4.1 Inhibitory effects of CJJYT on the overactivity of hippocampal neurons in depressed environment |
| 4.2 Regulatory effects of CJJYT on synaptic plasticity-related proteins and synaptic function |
（6）NaN3对大鼠纹状体神经元和PC12细胞凋亡的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 NaN_3对大鼠纹状体神经元的凋亡作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 NaN_3对PC12细胞凋亡的作用及其机制 |
| 第一节 NaN_3对PC12细胞存活率的影响 |
| 第二节 NaN_3对PC12细胞核形态的影响 |
| 第三节 NaN_3对PC12细胞凋亡率的影响 |
| 第四节 NaN_3对PC12细胞线粒体膜电位的影响 |
| 第五节 NaN_3对PC12细胞内活性氧生成的影响 |
| 第六节 NaN_3对PC12细胞内ATP生成的影响 |
| 第七节 NaN_3诱导PC12细胞凋亡的可能机制研究 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| Review The toxic effects of sodium azide and its possible molecular mechanisms |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 本课题支持 |
| 攻读博士期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（7）Hippocampal Gene Expression during the Estrous Cycle and Hippocampal Transcripts in Sex Difference in Animal Models of Depression（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Chapter Ⅰ Hippocampal gene expression profiles during the estrous cycle |
| 1.1 Introduction |
| 1.1.1 Estrogens |
| 1.1.1.1 Structure and function of estradiol |
| 1.1.1.2 Endogenous estradiol |
| 1.1.1.3 Estrogen receptors in the brain |
| 1.1.2 Dendritic spines and excitatory synapses |
| 1.1.3 Effects of estradiol on dendritic spines and excitatory synapses |
| 1.1.3.1 The effects of estradiol on dendritic spines and excitatory synapses in vivo |
| 1.1.3.2 The effects of estradiol on the spine density and plasticity of synapse incultured neurons in vitro |
| 1.1.4 The fluctuations of spine density and synapse number during the estrous cycle:Inhibition of local hippocampal estrogen synthesis results in synapse lossspecifically in female1.5 Regulations of learning and memory by estrogen |
| 1.1.5 Regulations of learning and memory by estrogen |
| 1.1.5.1 Exogenous estradiol effects on memory in female rats |
| 1.1.5.2 Exogenous estradiol effects on memory in male rats |
| 1.1.6 The signaling pathways: Molecular Mechanisms |
| 1.1.7 Estrogen regulates spine formation via regulating expression of synapticproteins |
| 1.1.8 Purpose and significance of the study |
| 1.1.8.1 Hypotheses |
| 1.1.8.2 Specific aims of the study |
| 1.1.8.3 Significance of the study |
| 1.2 Materials and Methods |
| 1.2.1 Experimental animals |
| 1.2.2 Chemicals |
| 1.2.3 Determination of the estrous cycle |
| 1.2.4 mRNA extractions and cDNA library preparation |
| 1.2.5 Analysis of RNA-Seq Data |
| 1.2.6 Gene enrichment analysis |
| 1.2.7 Analysis of mRNA levels by real-time quantitative reverse transcriptase PCR(qRT-PCR) |
| 1.2.8 Statistical Analysis |
| 1.3 Results |
| 1.3.1 Identification of PE and ES stages |
| 1.3.2 Gene expression profile in the hippocampus at the PE and ES stages |
| 1.3.3 Cellular and biological processes at the PE vs. ES stages |
| 1.3.4 Molecular and functional analysis of DEGs at the PE vs. ES stages |
| 1.3.5 The networks of E2-regulated DEGs at the PE and ES stages |
| 1.3.6 Validation of E2-responsive genes by qRT-PCR |
| 1.4 Discussion |
| 1.4.1 Gene expression profiles in the hippocampus during the estrous cycle |
| 1.4.2 E2 regulates the expression of genes which promote myelination, neuriteoutgrowth,learning and memory during the estrous cycle |
| 1.4.3 E2 influences the Serotonergic, and GABAergic synapses during the estrouscycle |
| 1.4.4 E2 alteres the signaling pathways which are involved in synaptic plasticityduring the estrous cycle |
| 1.4.5 E2 regulates the expression of genes involved in innate immune systemduring the estrous cycle |
| 1.4.6 E2 regulates the expression of genes which provide neuroprotection and areinvolved in memory via calcium signaling pathway |
| 1.4.7 E2 upregulates Klotho (Kl) signaling in the hippocampus |
| 1.4.8 E2 upregulates the development, transport, and metabolism related DEGs |
| 1.4.9 E2 upregulates DEGs involved in alterations of dendritic spines and synapseformation |
| 1.5 Conclusion |
| Chapter Ⅱ Estradiol alters hippocampal gene expression in ovariectomized rats |
| 2.1 Introduction |
| 2.2 Materials and Methods |
| 2.2.1 Animals |
| 2.2.2 Chemicals and Antibodies |
| 2.2.3 Treatments of Experimental Animals |
| 2.2.4 Ovariectomy and E2 replacement |
| 2.2.5 mRNA extractions |
| 2.2.6 cDNA library preparation |
| 2.2.7 Analysis of RNA-Seq Data |
| 2.2.8 Gene enrichment analysis |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 Western blot analysis |
| 2.2.11 Statistical analysis |
| 2.3 Results |
| 2.3.1 Confirmation of E2-responsive genes identified during the estrous cycle inOVX rats with E2 replacement |
| 2.3.2 Networks of E2-responsive biological processes and pathways in OVX rats |
| 2.3.3 Validation of E2-responsive genes by qRT-PCR |
| 2.3.4 Impact of ovarian hormone depletion and subsequent estradiol treatment onthe expression of Kl, Kcnj13,F5,and Sostdc 1 Genes |
| 2.3.5 Validation of E2-targeted AQP-1,and F5 using western blot |
| 2.4 Discussion |
| 2.4.1 Gene expression profiles in the hippocampus of OVX rats |
| 2.4.2 Comparing the gene expression profiles between the estrous cycle and OVXwith E2 replacement |
| 2.4.3 E2 influences signaling mechanisms through non-genomic effects in OVXand OVX treated E2 groups |
| 2.4.3.1 Klotho (Kl)signaling |
| 2.4.3.2 Transthyretin (Ttr) signaling |
| 2.4.3.3 Insulin like growth factor (IGF) and neuropeptide signaling |
| 2.4.4 E2 upregulates signaling pathways involved in synaptic plasticity in OVXtreated E2 groups |
| 2.4.5 E2 alters composition of extracellular matrix (ECM) in OVX and OVXtreated E2 groups |
| 2.4.6 E2 replacement modulates the expression of Kl,Kcnj 13,F5,and Sostdc 1Genes via ERa and ERβ |
| 2.4.7 E2 upregulates AQP 1 and F5 expression in OVX treated E2 groups |
| 2.5 Conclusion |
| Chapter Ⅲ Animal models for mimicking sex difference in depression |
| 3.1 Introduction |
| 3.2 Materials and Methods |
| 3.2.1 Animals |
| 3.2.2 Subchronic Variable Stress (SCVS) and Chronic Variable Stress (CVS) |
| 3.2.3 Chronic Unpredictable Mild Stress (CUMS) |
| 3.2.4 Behavioral assessments |
| 3.2.4.1 Sucrose preference test (SPT) |
| 3.2.4.2 Forced swim test (FST) |
| 3.2.4.3 Tail suspension test (TST) |
| 3.2.4.4 Open-field test (OFT) |
| 3.2.5 Sacrifice and Sample Preparation |
| 3.2.6 qRT-PCR |
| 3.2.7 Statistical analysis |
| 3.3 Results |
| 3.3.1 Male but not female rats are resilient to SCVS-induced depression-likebehaviors |
| 3.3.2 SCVS altered the mRNA levels of Otx2, Npas4, Pth2r, Robo2, Sgk2 genes infemale rats and HDAC2 mRNA levels in male rats |
| 3.3.3 Female but not male rats are resilient to CUMS-induced depression-likebehaviors |
| 3.3.4 CUMS induced alterations in the mRNA levels of Robo2 and Egr2 in thehippocampus |
| 3.4 Discussion |
| 3.5 Conclusion |
| CHAPTER Ⅳ Summary and Future Directions |
| 4.1 Summary |
| 4.2 Future directions |
| Bibliography |
| Appendix |
| Acknowlegment |
| Published Articles |
（8）参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 参知健脑方各组分药物改善认知机制研究 |
| 1 人参 |
| 1.1 中医认识 |
| 1.2 化学成分 |
| 1.3 改善认知机制 |
| 2 知母 |
| 2.1 中医认识 |
| 2.2 化学成分 |
| 2.3 改善认知机制 |
| 3 赤芍 |
| 3.1 中医认识 |
| 3.2 化学成分 |
| 3.3 改善认知机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 神经元突触囊泡内吞途径对神经系统疾病的影响 |
| 1 网格蛋白介导的内吞作用(CME)与神经系统疾病 |
| 1.1 网格蛋白包被组装 |
| 1.2 质膜内陷和凹窝形成 |
| 1.3 凹陷收缩和剪切 |
| 1.4 囊泡去包被 |
| 2 Kiss and run途径 |
| 3 不依赖网格蛋白的大量内吞作用(clathrin-independent bulk endocytosis,CIE) |
| 4 超速内吞作用 |
| 5 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 基于网络药理学的参知健脑方治疗血管性痴呆机制研究 |
| 1 研究材料 |
| 1.1 数据库 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 参知健脑方入血活性化学成分的检索与筛选 |
| 2.2 参知健脑方药物成分-靶点、VD疾病-靶点及参知健脑方治病靶点的预测 |
| 2.3 参知健脑方活性成分-VD-靶点的网络构建 |
| 2.4 基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 参知健脑方潜在入血活性化学成分的筛选结果 |
| 3.2 参知健脑方药物成分-靶点、VD疾病-靶点及参知健脑方治病靶点预测结果 |
| 3.3 参知健脑方-活性成分-VD靶点的网络构建 |
| 3.4 GO功能及KEGG通路富集分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医药研究与网络药理学 |
| 4.2 参知健脑方的理法方药分析 |
| 4.3 参知健脑方的网络药理学分析 |
| 5 小结 |
| 第二部分 参知健脑方和谷氨酸干预浓度筛选及其对拟VD细胞模型增殖及毒性的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12细胞培养 |
| 2.2 谷氨酸诱导PC12细胞损伤的最适宜造模浓度筛选及参知健脑方低、中、高剂量适宜浓度筛选(CCK-8法) |
| 2.3 谷氨酸造模适宜浓度及干预药物适宜浓度的筛选验证(IncuCyte长时间动态活细胞成像及功能分析系统) |
| 2.4 谷氨酸诱导损伤PC12细胞模型的建立及分组给药 |
| 2.5 CCK-8法检测各组细胞增殖及毒性 |
| 2.6 IncuCyte长时间动态活细胞成像及功能分析系统检测各组细胞增殖及毒性2.7 CFSE细胞增殖实验 |
| 2.7 CFSE细胞增殖实验 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 生理状态下PC12细胞的形态学特征 |
| 3.2 不同浓度谷氨酸和参知健脑方溶液对PC12细胞增殖及毒性的影响 |
| 3.3 参知健脑方对拟VD细胞模型的增殖及毒性影响 |
| 3.4 CFSE细胞增殖实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 “毒损脑络”与VD |
| 4.2 “毒损脑络”的现代生物学内涵 |
| 4.3 “解毒通络”是治疗VD的重要法则 |
| 4.4 谷氨酸诱导损伤PC12细胞模型的建立 |
| 4.5 参知健脑方对谷氨酸损伤PC12细胞的增殖及毒性作用 |
| 5 小结 |
| 第三部分 参知健脑方对拟VD细胞模型周期、凋亡、钙离子浓度及活性氧的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PC12细胞培养 |
| 2.2 谷氨酸损伤的PC12细胞模型的建立及各组给药 |
| 2.3 流式细胞术检测PC12细胞周期 |
| 2.4 流式细胞术检测PC12细胞凋亡 |
| 2.5 高内涵细胞成像分析系统检测PC12细胞内游离钙离子浓度、活性氧及超氧化物的水平 |
| 2.6 qRT-PCR技术检测PC12细胞caspase-3 mRNA的相对表达水平 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 PC12细胞周期检测结果 |
| 3.2 PC12细胞凋亡检测结果 |
| 3.3 PC12细胞内游离钙离子浓度、活性氧及超氧化物的水平检测结果 |
| 3.4 参知健脑方对谷氨酸损伤PC12细胞caspase-3 mRNA表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 参知健脑方与谷氨酸损伤的PC12细胞周期阻滞 |
| 4.2 参知健脑方与谷氨酸损伤的PC12细胞凋亡 |
| 4.3 参知健脑方与谷氨酸诱导的PC12细胞内钙超载及氧化应激损伤 |
| 4.4 “解毒通络”法则的部分生物学内涵 |
| 5 小结 |
| 第四部分 参知健脑方对拟VD细胞模型clathrin介导的NMDA受体胞吞过程的作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 主要实验药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞免疫荧光技术检测PC12细胞clathrin、RAB5B和NMDAR1的分布和表达水平 |
| 2.2 qRT-PCR检测PC12细胞clathrin mRNA和NMDAR1 mRNA的表达水平 |
| 2.3 Western Blot检测PC12细胞clathrin、RAB5B及NMDAR1的表达水平 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 PC12细胞的细胞免疫荧光检测结果 |
| 3.2 PC12细胞的qRT-PCR检测结果 |
| 3.3 PC12细胞的Western Blot检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 参知健脑方与clathrin介导的细胞内吞作用 |
| 4.2 参知健脑方与NMDA受体的内吞过程 |
| 4.3 “解毒通络”法则的部分生物学内涵 |
| 5 小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（9）BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 岛叶BDNF在条件性味觉厌恶记忆消退中作用的研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 BDNF分泌及其调控分子在缺血性脑卒中记忆损伤中的作用 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 BDNF及其调控分子在脑卒中功能障碍中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 创新点及局限性 |
| 研究结论 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章一 |
| 英文文章二 |
（10）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Experimental Study of Effect of Corticosterone on Primary Cultured Hippocampal Neurons and Their Ca~(2+) /CaMKⅡ Expression（论文参考文献）
- [1]Establishment of injury models in studies of biological effects induced by microwave radiation[J]. Yun-Fei Lai,Hao-Yu Wang,Rui-Yun Peng. Military Medical Research, 2021(02)
- [2]基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响[D]. 任非非. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究[D]. 胡文继. 吉林大学, 2021
- [4]Functional repertoire of protein kinases and phosphatases in synaptic plasticity and associated neurological disorders[J]. Raheel Khan,Don Kulasiri,Sandhya Samarasinghe. Neural Regeneration Research, 2021(06)
- [5]复方柴金解郁片通过改善海马神经元突触功能发挥抗抑郁作用（英文）[J]. 李姿蓉,韩远山,吴梦瑶,刘检,金狮,张熙,王宇红. Digital Chinese Medicine, 2020(02)
- [6]NaN3对大鼠纹状体神经元和PC12细胞凋亡的作用及其机制[D]. 左媛宜. 苏州大学, 2020(06)
- [7]Hippocampal Gene Expression during the Estrous Cycle and Hippocampal Transcripts in Sex Difference in Animal Models of Depression[D]. Javed Iqbal. 陕西师范大学, 2020(02)
- [8]参知健脑方对拟血管性痴呆细胞模型的神经保护作用及机制研究[D]. 田丹枫. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]BDNF在记忆消退及缺血性脑卒中诱导的记忆损伤中的作用机制[D]. 刘殿玮. 山东大学, 2020(12)
- [10]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020