一、人胆管癌裸鼠移植瘤2号模型的建立（论文文献综述）
黄天璐[1]（2020）在《细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究》文中指出背景和目的胆管癌是一种预后极差的肿瘤,主要原因是现有的临床治疗方案疗效有限。目前胆管癌常用的治疗方案是根治性手术切除、肝移植和化疗,由于缺乏早期临床症状,许多患者在确诊时已经处于进展期,而胆管癌对化疗并不敏感,导致这些失去根治性手术或肝移植机会的病人的中位生存期不足48个月。因此,亟需寻找有效的新的抗胆管癌靶点及药物并制定有效的治疗方案。2016年的一项研究,通过对现有胆管癌的基因表达综合数据库进行整合分析,发现胆管癌与正常组织相比存在48个差异表达的转录因子,并且细胞周期相关基因在胆管癌中富集程度最高。因此,为了寻找新的抗胆管癌的有效靶点,我们在三株胆管癌细胞中,对一个靶向细胞周期基因的小分子抑制剂库进行了抗肿瘤活性药物筛选,结果发现胆管癌细胞对细胞周期蛋白依赖激酶7（CDK7）抑制剂普遍敏感。CDK7是CDK家族的成员之一,控制转录起始和延伸,并参与细胞周期的调控。近年来有研究显示,CDK7参与介导调控了一些重要的基因簇的转录,这些基因簇常与超级增强子相关。此外,CDK7在肿瘤组织中的表达常常升高,因此CDK7在肿瘤中可能是一个重要的潜在治疗靶点。本研究的目的是评估CDK7在胆管癌细胞中的作用,探究CDK7抑制剂的抗胆管癌作用机制,并探究与其他抑制剂的协同抗胆管癌方案,为临床治疗胆管癌提供新的思路与策略。方法利用TCGA数据及GEO中的数据分析CDK7的m RNA在胆管癌中的表达,并利用组织芯片进行免疫组化,验证CDK7在胆管癌组织中的蛋白表达水平及CDK7与MCL1表达的相关性。使用药物处理或小干扰RNA（si RNA）沉默目的基因的表达后,使用CCK-8检测细胞活性,使用Compu Syn软件计算药物之间的联合指数（CI）。利用流式细胞术检测细胞凋亡、Caspase3/7试剂盒检测细胞内caspase3/7活性、Brd U ELISA增殖试剂盒检测细胞增殖。通过Real-time q PCR检测目的基因的m RNA水平、Western blot检测目的基因的蛋白表达。通过构建裸鼠皮下移植瘤并进行体内给药实验,探究CDK7抑制剂THZ1对胆管癌移植瘤生长的影响,并观察对裸鼠是否存在明显的毒副反应。THZ1处理胆管癌细胞后,进行RNA测序,对测序结果进行分析,寻找下游靶点,探究分子机制。结果对TCGA数据及GEO中的数据集的分析结果以及免疫组化结果显示,CDK7在胆管癌组织中的表达明显高于癌旁组织及正常组织。使用小分子抑制剂抑制CDK7活性或使用si RNA沉默CDK7表达可以抑制胆管癌细胞的活性,抑制胆管癌细胞增殖并促进凋亡发生。THZ1可以抑制胆管癌皮下移植瘤的生长,且对裸鼠体重及活力没有明显的抑制作用。THZ1可以下调CDK7介导的RNP2的磷酸化,抑制转录进程。对RNA测序结果进行GO分析显示,THZ1对DNA转录相关的基因影响较大。在被THZ1显着下调的基因中包含许多致癌转录因子和存活蛋白如FOSL1、RUNX1和MCL1。MCL1是胆管癌重要的抗凋亡蛋白,免疫组化显示CDK7的表达与MCL1具有明显相关性。利用si RNA干扰MCL1的表达或使用MCL1抑制剂可增强BCL2/BCL-XL抑制剂ABT-263的抗胆管癌作用,联合使用CDK7抑制剂或si RNA与ABT-263可发挥协同抗胆管癌作用,显着增加细胞凋亡。结论CDK7抑制剂THZ1可以抑制胆管癌细胞存活,促进胆管癌细胞凋亡,并显着抑制基因转录。同时,THZ1可通过抑制抗凋亡蛋白MCL1的表达,与ABT-263发挥协同抗胆管癌作用。因此,CDK7可能是治疗胆管癌的有效靶点,同时抑制CDK7与BCL2/BCL-XL可能成为胆管癌治疗新策略。
林海[2]（2020）在《Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究》文中认为第一部分胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义目的:研究Lnc-ATB与miR-200c在胆管癌组织中的表达及相关性,初步探讨其临床意义。方法:应用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200（miR-200a/b/c）在30例胆管癌组织及相应非癌组织中的表达。对两者表达量进行相关性分析,并结合患者的临床病理资料分析其临床意义。结果:通过比较30例胆管癌患者肿瘤组织及其相应非癌组织中Lnc-ATB及miR-200a/b/c表达水平,发现胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高（3.807±0.907 VS1.049±0.510,P<0.001）,而miR-200a（2.260±0.899 VS 3.099±1.062,p<0.05）,miR-200b（1.338±0.587 VS 2.268±0.510,P<0.001）及miR-200c（0.469±0.251 VS1.452±0.410,P<0.001）表达均降低,其中以miR-200c表达降低最为明显。相关性分析提示胆管癌组织中Lnc-ATB高表达与miR-200c低表达密切相关（P<0.01）。Lnc-ATB呈高表达的胆管癌患者肿瘤体积较大,容易合并淋巴结转移,TNM分期较晚。而miR-200c呈低表达的胆管癌患者容易合并淋巴结转移,具有较晚的TNM分期。结论:胆管癌组织中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,两者表达呈负相关。Lnc-ATB可能在胆管癌中发挥癌基因作用,而miR-200c可能发挥抑癌基因作用。第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能目的:通过体外实验探讨Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中的表达及生物学作用。方法:应用q RT-PCR方法检测胆管癌细胞系HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28和人支气管上皮细胞BEC中Lnc-ATB/miR-200c的表达。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中的Lnc-ATB表达水平,用q RT-PCR方法检测Lnc-ATB及miR-200c表达水平的变化。将Hu CCT1细胞同时转染带有野生型或突变型psi CHECK2-Lnc-ATB结合位点的质粒与miR-200c模拟物。转染后48h用双荧光素酶报告基因检测试剂盒进行荧光素酶活性测定,结合生物信息学分析,初步确定Lnc-ATB与miR-200c的调控关系及结合位点。采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组,应用q RT-PCR方法检测各组细胞miR-200c表达水平变化。通过CCK8细胞增殖实验、流式细胞周期实验及细胞凋亡实验、Transwell试验分析Lnc-ATB/miR-200c信号轴对HUCCT1和RBE细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。结果:与正常BEC细胞相比,Lnc-ATB在HUCCT1、RBE、TFK1、Huh-28四种胆管癌细胞株中呈高表达,而miR-200c呈相对低表达,其中以HUCCT1、RBE细胞最为明显,因此选择HUCCT1、RBE细胞进行si RNA干扰实验。si RNA干扰实验显示敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达可以提高miR-200c的表达水平,并且si RNA1干扰效果优于si RNA2,因此采用si RNA1序列进行后续试验。生物信息学分析表明,Lnc-ATB含有潜在的miR-200c结合位点,预测miR-200c为Lnc-ATB的靶基因。双荧光素酶报告分析表明,miR-200c模拟物可以明显抑制带有野生型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB的荧光素酶活性,而在带有突变型miR-200c结合位点的psi CHECK2-Lnc-ATB中没有观察到这种现象。应用si RNA-Lnc-ATB体外敲低HUCCT1和RBE细胞Lnc-ATB表达可以升高miR-200c的表达水平,从而导致细胞增殖活力以时间依赖性方式下降,并促进细胞凋亡及G0/G1期阻滞,抑制细胞的迁移能力。然而,当将miR-200c抑制剂共转染入细胞以降低miR-200c表达时,可以逆转si RNA-Lnc-ATB对胆管癌细胞增殖、凋亡、G0/G1期阻滞及迁移能力的抑制。结论:胆管癌细胞中Lnc-ATB表达升高,miR-200c表达降低,Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达参与调控胆管癌细胞的生长及迁移过程。第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制目的:研究Lnc-ATB/miR-200c相关信号通路因子在胆管癌细胞中的表达,为后续进一步研究提供理论指导。方法:采用si RNA技术敲低HUCCT1和RBE细胞中Lnc-ATB的表达,结合共转染miR200c抑制剂建立三组不同Lnc-ATB/miR200c表达水平的细胞。三组细胞分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组（si RNA-Lnc-ATB组）,si RNA-Lnc-ATB+共转染miR200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。应用Western blotting检测三组细胞之间细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:体外敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达可以抑制CCND1/CDK2表达,升高Caspase-3表达,降低BCL-2表达,抑制ZEB1/2表达,上调E-cadherin表达并下调N-cadherin表达。而将miR-200c抑制剂共转染入HUCCT1细胞后可以抑制miR-200c表达上调,进而逆转上述分子蛋白的表达变化。结论:Lnc-ATB通过抑制miR-200c表达调控胆管癌细胞周期、凋亡及EMT相关信号通路因子的表达,从而促进胆管癌细胞的增殖及迁移。第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用目的:研究Lnc-ATB/miR-200c信号轴对胆管癌细胞成瘤作用及体内相关信号通路因子表达的影响,初步探讨其是否可能作为胆管癌诊断及治疗的潜在分子靶标。方法:设计包装携带有lentivirus-RNAi-Lnc-ATB,miR-200c抑制剂及阴性对照（negative control）的慢病毒,先利用该病毒感染HUCCT1细胞系,得到长期稳定表达的三组细胞,分别为单纯敲低Lnc-ATB表达组,敲低Lnc-ATB表达+共转染miR-200c抑制剂组及阴性对照组（NC组）。采用5周BALB/c裸鼠,随机分为三组,每组5只,分别取符合条件的三组HUCCT1细胞悬液建立裸鼠皮下移植瘤模型,连续饲养观察3周,每隔3天观察并记录期间肿瘤体积变化。待饲养3周后将裸鼠处死,比较肿瘤体积大小。采用免疫组织化学方法分析细胞增殖标志物PCNA在三组裸鼠肿瘤组织中的表达水平。利用Western blotting检测三组裸鼠肿瘤组织中细胞周期相关蛋白CCND1/CDK2、细胞凋亡相关蛋白BCL-2/Caspase-3及EMT相关信号通路因子ZEB1/2及E-cadherin/N-cadherin的表达差异。结果:采用慢病毒转染技术敲低HUCCT1细胞Lnc-ATB表达构建的裸鼠皮下移植瘤组织体积较小并伴有PCNA表达降低,而同时稳定转入miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠肿瘤组织体积及PCNA表达可以恢复。采用慢病毒转染技术敲低Lnc-ATB表达的HUCCT1细胞构建的裸鼠皮下移植瘤中的CCND1/CDK2及BCL-2表达降低,Caspase-3表达升高,ZEB1/2及N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高。而稳定转入si RNA-Lnc ATB+miR-200c抑制剂的肿瘤细胞构建的裸鼠移植瘤组织可以恢复其表达。结论:Lnc-ATB/miR-200c通过调控细胞周期、细胞凋亡及EMT相关信号通路因子表达促进胆管癌细胞的成瘤作用。Lnc-ATB/miR-200c或许可能成为胆管癌诊治的潜在分子靶标。
刘磊[3]（2019）在《ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖与转移的作用与机制》文中指出胰腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是一种恶性程度较高、预后较差的消化系肿瘤,在我国由于生活水平的提高和不良饮食生活习惯等因素,导致胰腺癌近20年来发病率增长约6倍,死亡率位居恶性肿瘤第5位。手术切除仍然是胰腺癌首选治疗方法,所以,如何提高胰腺癌的术前诊断率,严格掌握手术指征,提高手术切除率是保证胰腺癌患者获得良好疗效的关键。胰腺癌近几年流行病学研究表明其5年生存率仍然较低,约为8.5%,其中最重要的原因为其生物学行为恶性程度高,侵袭性强,病程较早时就可能伴有淋巴结转移和神经脉管的浸润,故很多患者确诊时已是疾病的进展期,较快出现局部和远处转移。由于胰腺癌缺少早期发现的标志物,因此,如何寻找胰腺癌早期发生发展的标志物,是提高患者预后的关键因素。近年来,越来越多的学者发现既往没有被受到重视的非编码基因如微小 RNA（microRNA,miRNA）、环状 RNA（circular RNA,circRNA）、长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）等与肿瘤发生、发展密切相关,部分非编码基因甚至可以作为肿瘤早期发现的标志物用于临床诊断。miRNA是真核生物中存在的一类约22～24个核苷酸大小,参与转录后基因调节的非编码单链小分子RNA,可通过特异性识别靶基因的Messenger ribonucleic acid（mRNA）的3’-UTR非翻译区（3’-UTR）并与之结合,引起靶基因mRNA翻译的抑制,从而对靶基因进行转录后表达调节,最终通过影响靶基因表达而参与肿瘤的恶性进程。通过Pubmed、万方数据库和Google学术搜索发现miRNA-7作为细胞中广泛存在的非编码抑癌基因,在众多肿瘤（包括肝癌、宫颈癌、肺癌等）的增殖及转移中起重要作用,并且是患者早期诊断的标志物及影响患者预后的关键因素,然而,在胰腺癌的增殖和转移过程中miRNA-7研究目前罕见报道。circRNA是具有基因表达调控作用的非编码RNA,其主要通过套索内含子或反向拼接的方式产生,具有结构稳定和组织表达特异性等一系列特征,这些特征赋予了 circRNA不同的功能,例如,作为miRNA海绵,能与miRNA竞争性结合,干扰miRNA对靶mRNA的抑制和调控作用,从而影响下游靶基因的表达及其蛋白的合成,此外,有研究显示circRNA不但可以抑制miRNA活性,而且,还可抑制miRNA的表达。其中具有代表性的研究即发现小脑变性相关蛋白1反义转录物（CDRlas）,也称做ciRS-7,其包含了 70多个miRNA的别位点,最具特征性的就是可以抑制miRNA-7活性和表达,从而提高miRNA-7的靶基因表达影响生物学功能。最近在喉鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的研究中,证实ciRS-7可以通过抑制miRNA-7调节信号转导和转录活化因子 3（Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）、细胞周期蛋白E1（Cyclin E1,CCNE1）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基 δ（Phosphoinositide-3 kinase,catalytic subunit delta,PIK3CD）等靶基因信号通路关键蛋白的表达影响肿瘤的增殖和侵袭特性。研究已证实EGFR/STAT3信号转导通路在乳腺癌、胶质瘤、肺癌等许多肿瘤中异常表达,并影响肿瘤的增殖和转移。基于此,我们拟探索在胰腺癌中ciRS-7和miRNA-7表达,及其对胰腺癌生物性特性的影响。进一步明确ciRS-7通过与miRNA-7竞争性结合而调节miRNA-7靶基因EGFR等表达,进而影响EGFR/STAT3信号通路活性的作用和机制,探索ciRS-7影响胰腺癌生物学特性的机制。查阅文献后发现迄今为止相关文献报道较少。本课题主要分为三个部分:第一部分ciRS-7与miRNA-7在胰腺癌组织中的表达及临床意义研究目的:研究ciRS-7与miRNA-7等在胰腺癌组织中的表达情况,并探索ciRS-7在组织中的表达与胰腺癌生物学特性的关系,如与肿瘤的发生发展,侵袭和转移的关系,并分析ciRS-7对胰腺癌临床预后预测的意义。研究方法:本研究获得安徽省立医院伦理委员会批准,在安徽省立医院普外科共获取胰腺癌及癌旁组织标本41例,所有胰腺癌患者均签署知情同意书,进行后续研究。1.通过实时定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR）方法检测 41 例胰腺癌及其癌旁新鲜冰冻组织标本中ciRS-7和miRNA-7表达情况,并将ciRS-7和miRNA-7的表达情况进行相关性分析,探索ciRS-7和miRNA-7的表达与肿瘤发生、发展的关系。2.将胰腺癌组织中ciRS-7的表达与临床病例资料进行统计分析,探索其表达与肿瘤位置、大小、淋巴结转移以及局部神经浸润等因素是否相关。3.通过免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测分析 EGFR、STAT3 在胰腺癌及癌旁等组织中的表达情况,并与临床病例资料进行统计分析。4.术后进行患者随访,分析ciRS-7的高表达对胰腺癌临床预后预测的意义。结果:1.ciRS-7在胰腺癌组织中表达高于癌旁组织,差异具有统计学意义（P=0.002）,而miRNA-7在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织,差异具有统计学意义（P=0.048）。Spearman相关性分析研究发现在胰腺癌中ciRS-7和miRNA-7表达具有负相关性(P=0.023。2.对于临床资料的统计发现,ciRS-7在胰腺癌中表达水平与肿瘤是否有淋巴结转移（P=0.016）及是否有神经浸润（P=0.028）相关,而与患者的性别、年龄、有无糖尿病、肿瘤位置、肿瘤大小等无明显相关,差异无统计学意义（民P>0.05）。3.免疫组化检测发现EGFR、STAT3在胰腺癌中表达高于癌旁组织,EGFR、STAT3在胰腺癌中表达水平均与肿瘤是否有淋巴结转移（P<0.05）相关,而与患者的性别、年龄、肿瘤位置等无明显相关,差异无统计学意义（P>0.05）。4.通过随访1年后,发现在胰腺癌患者中ciRS-7高表达者的无瘤生存率低于ciRS-7低表达者,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:ciRS-7在胰腺癌中表达高于癌旁组织,miRNA-7在胰腺癌中表达低于癌旁组织,并且两者表达具有负相关性。ciRS-7的表达与肿瘤的有无淋巴结转移和有无神经浸润相关。在胰腺癌组织中EGFR、STAT3高表达并与肿瘤增殖、侵袭生物学特性有关。术后随访显示ciRS-7高表达可能是胰腺癌预后的一个评估指标。故组织学研究表明ciRS-7和miRNA-7等表达与肿瘤发生发展可能相关,并为胰腺癌的诊断和预后分析提供依据。第二部分 体外探讨ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制研究目的:通过体外研究探讨ciRS-7和miRNA-7在胰腺癌增殖和转移中的作用及其机制研究方法:1.通过QRT-PCR法检测胰腺癌细胞株（BXPC-3、PANC-1）以及正常胰腺细胞HPC-Y5 中 ciRS-7、miRNA-7 表达情况,通过小干扰 RNA（Small interfering RNA,siRNA）siciRS-7、simiRNA-7 实现胰腺癌 BXPC-3、PANC-1 细胞中 ciRS-7、miRNA-7的沉默。2.QRT-PCR检测ciRS-7沉默组、ciRS-7与miRNA-7同时沉默组、对照（Control）组以及阴性对照（Negative control,NC）组等各组中miRNA-7表达情况。3.通过MTT细胞增殖实验检测BXPC-3、PANC-1各组细胞增殖能力变化情况。4.Transwell小室检测BXPC-3、PANC-1各组细胞侵袭能力变化情况。5.通过QRT-PCR法及Western blotting法检测各组中EGFR/STAT3的表达情况。6.各实验组细胞中加入EGFR/STAT3信号通路的特异性阻断剂吉非替尼后,再通过MTT细胞增殖试验和Transwell小室法检测各组细胞的增殖和侵袭能力变化的情况。结果:1.胰腺癌细胞BXPC-3及PANC-1中ciRS-7表达均高于正常胰腺细胞HPC-Y5（P<0.05）。siciRS-7、simiRNA-7 可有效沉默 ciRS-7、miRNA-7 在 BXPC-3 和 PANC-1中的表达。并分别在BXPC-3及PANC-1细胞系中筛选出ciRS-7低表达最明显的siciRS-7-1,和 ciRS-7 与 miRNA-7 同时低表达的 siciRS-7-1+simiRNA-7 用于后续研究。2.QRT-PCR检测发现siciRS-7-1组中miRNA-7表达情况高于Control组和NC组（P<0.05）;siciRS-7-1+simiRNA-7 组中 miRNA-7 表达与 Control 组相比差异无统计学意义（P>0.05）。3.通过MTT法发现siciRS-7-1组癌细胞的增殖能力明显低于Control组和NC组（P<0.05）,而siciRS-7-1+simiRNA-7组细胞的增殖能力与Control组相比差异无统计学意义（P>0.05）。Transwell小室法发现siciRS-7-1组癌细胞的侵袭能力明显低于Control 组和 NC 组（P<0.05）,siciRS-7-l+simiRNA-7 组细胞的侵袭力与 Control 组相比差异无统计学意义（P>0.05）。4.siciRS-7-1组胰腺癌细胞中EGFR、STAT3的表达低于Control组（P<0.05）,siciRS-7-1+simiRNA-7组中EGFR、STAT3的表达与Control组相比差异无统计学意义（P>0.05）。5.加入EGFR/STAT3阻断剂吉非替尼后,siciRS-7-1组中对于细胞的增殖和侵袭能力无明显影响（P>0.05）,而Control组加入吉非替尼后的增殖和侵袭能力变化明显（P<0.05）。结论:体外研究阐明了在胰腺癌细胞中ciRS-7高表达,下调ciRS-7可促进miRNA-7上调表达,从而抑制miRNA-7下游的靶基因信号通路EGFR/STAT3表达,最终抑制肿瘤的增殖和转移过程,表明了 ciRS-7可促进胰腺癌细胞的增殖和转移,这些为肿瘤靶向治疗提供研究基础。第三部分 体内探讨c iRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制研究目的:通过体内实验研究验证ciRS-7可通过miRNA-7调控EGFR/STAT3信号通路影响胰腺癌的增殖和转移。研究方法:1.将siciRS-7-1、siciRS-7-1+simiRNA-7等胰腺癌PANC-1细胞分别注射在裸鼠皮下和腹腔,成功建立胰腺癌的裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型。2.对于皮下移植瘤模型,饲养4周后,处死裸鼠剥取肿瘤后称重和测量体积。对于腹腔转移瘤模型,观察裸鼠腹部情况,饲养4周后处死各组裸鼠,观察各组裸鼠的肝肺转移情况。3.应用QRT-PCR法检测各种模型肿瘤组织中miRNA-7表达情况。4.应用免疫组化检测各种模型肿瘤组织中EGFR、STAT3蛋白的表达情况。结果:1.成功建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型。2.siciRS-7-1组皮下移植瘤的体积和瘤重明显小于Control组（P<0.05）。腹腔转移瘤模型中siciRS-7-1组的肝肺转移的发生情况明显少于Control组（P<0.05）。3.QRT-PCR发现miRNA-7在两种模型的siciRS-7-1组中表达均高于Control组（P<0.05）。4.免疫组化结果显示两种模型中siciRS-7-1组的EGFR、STAT3蛋白阳性表达均低于Control组（P<0.05）。结论:体内实验进一步证实在胰腺癌中下调ciRS-7可促进miRNA-7的表达,并可通过抑制其下游的靶基因信号通路EGFR/STAT3表达抑制肿瘤的增殖和转移过程。全文结论:ciRS-7在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,其表达与肿瘤的淋巴结转移和神经浸润进程有一定的相关性,是评估胰腺癌预后的重要指标。在胰腺癌细胞中ciRS-7高表达,下调ciRS-7表达可促进miRNA-7上调表达从而抑制EGFR/STAT3信号通路抑制肿瘤的增殖和侵袭。综合研究表明ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖与转移。ciRS-7有望为胰腺癌的早期诊断和治疗提供新的潜在靶点,为后续肿瘤基因靶向治疗提供研究基础。
杨涛[4]（2019）在《肿瘤相关巨噬细胞和胆管癌细胞相互作用促进胆管癌的发展及耐药》文中提出第一部分肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞对吉西他滨化疗抵抗目的:诱导建立肿瘤相关巨噬细胞模型并鉴定表型,检测肿瘤相关巨噬细胞对胆管癌细胞化疗耐药的影响,验证其对胆管癌细胞凋亡过程的调节。方法:综合文献经典方案用细胞因子诱导人单核细胞THP-1,使其分化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,并通过流式细胞数及RT-PCR验证相应标志物表达。CCK8、流式及WB用以检测TAM诱导的胆管癌细胞对吉西他滨化疗耐药,验证其对于细胞凋亡的影响。结果:所有巨噬细胞分型CD11b均高表达,其中M1型CD80与IL12高表达,而M2型CD206与IL10高表达。CCK8结果显示显示TAM条件培养基（CM）显着降低胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性;流式细胞学证明药物抗性是通过减少吉西他滨诱导的细胞凋亡来介导的;WB显示在TAM-CM孵育时吉西他滨诱导胆管癌细胞的活化caspase-3表达显着减少。结论:肿瘤相关巨噬细胞模型建立成功,其通过减少吉西他滨诱导的胆管癌细胞凋亡来介导化疗抵抗。第二部分a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞耐药目的:探讨a PKCι介导肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞耐药的机制。方法:建立稳定过表达和低表达a PKCι的人胆管癌细胞系,WB检测a PKCι过表达或低表达的人胆管癌细胞中磷酸化NF-κB、P62以及核蛋白中NF-κB表达情况,并通过双荧光素酶报告基因系统验证NF-κB活化情况;锚定非依赖实验检测上述细胞转化生长能力并验证NF-κB抑制剂（PDTC）对于a PKCι介导的转化生长的影响。WB检测TAM-CM诱导的吉西他滨耐药的细胞中a PKCι、NF-κB的活化情况以探索诱导耐药的信号通路。WB及双荧光素酶报告基因系统检测P62是否参与a PKCι/NF-κB信号通路。氨基酸点突变技术及IP实验验证a PKCι通过P62调控NF-κB的机制。结果:在体外,上调人胆管癌细胞a PKCι表达,P-a PKCι、P-NF-κB以及入核NF-κB表达明显增多,同时双荧光素酶报告基因系统也证实NF-κB活化增强,反之下调a PKCι表达时上述分子表达则相应减少;a PKCι过表达时胆管癌细胞转化生长能力增强,而NF-κB抑制剂（PDTC）则逆转此现象;TAM-CM诱导的吉西他滨耐药的细胞中a PKCι、NF-κB的活化均较空白和对照组增强;靶向沉默人胆管癌细胞中P62的表达,NF-κB活化程度降低;PB1结构域点突变后,a PKCι与P62结合被抑制。结论:在体外a PKCι通过调控NF-κB入核活化促进胆管癌细胞转化生长;肿瘤相关巨噬细胞诱导通过a PKCι/NF-κB信号通路诱导胆管癌细胞耐药;a PKCι与P62通过PB1结构域相互结合并作用,促进NF-κB活化。第三部分a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导的胆管癌细胞上皮间质转化目的:在第二部分实验提示a PKCι/NF-κB信号通路参与肿瘤相关巨噬细胞对胆管癌细胞作用的基础上,进一步探讨a PKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导的胆管癌细胞上皮间质转化。方法:荧光素酶报告基因系统检测用TGFβ1处理胆管癌细胞以及添加TGFβ1受体抑制剂或TGFβ1中和抗体处理后的NF-κB活性变化;用WB检测在不同时间梯度下TGFβ1处理a PKCι表达不同的胆管癌细胞中a PKCι/NF-κB信号通路活化情况;共聚焦验证TGFβ1是否促进NF-κB入核;RT-PCR及ELISA检测TAM中TGFβ1的表达;WB检测a PKCι表达不同的胆管癌细胞在TAM-CM培养下a PKCι/NF-κB信号通路活化情况,并用对应的抑制剂或si RNA验证TGFβ1、a PKCι及NF-κB在其中的关键作用;细胞形态学、免疫荧光及WB检测TAMCM诱导的胆管癌细胞EMT表型及标志物变化,并通过相应抑制剂及中和抗体验证TGFβ1及NF-κB在其中的关键作用;划痕及侵袭实验体外验证TAMCM诱导的胆管癌细胞EMT的体外效应。在体内,使用BALB/c裸鼠建立皮下成瘤和肺转移模型,检测肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌生长和转移变化,验证a PKCι在其中扮演角色,并用免疫组化检测P-a PKCι及F4/80（巨噬细胞）表达。结果:TGFβ1能够诱导NF-κB活化,并可被TGFβ1中和抗体及其受体抑制剂抑制;随着TGFβ1处理时间增加,胆管癌细胞a PKCι/NF-κB活化不断增强,并在处理3-5h间达到顶峰,而a PKCι低表达时,所有效应均减弱;共聚焦扫描显示TGFβ1促进NF-κB入核,且该效应可被a PKCι-si RNA及NF-κB抑制剂PDTC所抑制;RT-PCR及ELISA检测TAM中TGFβ1的表达相对于其他表型巨噬细胞明显增多;在TAM-CM培养下胆管癌细胞中P-a PKCι、P-NF-κB表达增多,而当a PKCι过表达时P-a PKCι、P-NF-κB表达明显增强,该效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时被逆转;在TAM-CM培养下胆管癌细胞形态变长梭形,免疫荧光及WB显示上皮标志物E-cad表达减少、间质标志物Vimentin表达增多,而以上效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时可被逆转;胆管癌细胞在TAM-CM孵育下侵袭能力、迁移能力和增殖能力增强,而此效应在PDTC处理及TGFβ1抑制时可被逆转;在体内实验中,当巨噬细胞清除时,形成皮下肿瘤的体积明显减小,形成肺转移结节的数目也减少;免疫组化结果显示P-a PKCι在皮下肿瘤和肺转移结节中的表达随着巨噬细胞清除而减少。结论:在胆管癌细胞中,a PKCι介导TGFβ1诱导NF-κB活化;TAM分泌TGFβ1通过a PKCι/NF-κB信号通路诱导胆管癌细胞上皮间质转化,并促进肿瘤体内生长和转移。第四部分a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞分泌CCL5招募并诱导巨噬细胞M2型极化目的:进一步探索两种细胞间的相互作用关系,探讨a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞招募巨噬细胞形成正反馈环路的分子机制。方法:定量检测抗体（Raybio）芯片技术分析稳定高表达a PKCιi胆管癌细胞与正常细胞相比,培养液上清中的差异性免疫因子;RT-PCR及ELISA检测间充质样胆管癌细胞中的CCL5表达,并验证PDTC对于CCL5表达的影响;构建野生型和突变型CCL5启动子荧光素酶报告质粒,瞬时转染分析胆管癌细胞在TGFβ1和/或TNFa处理时的相对荧光强度;流式细胞学及RT-PCR检测孵育在间充质样胆管癌细胞条件培养基中或CCL5处理的THP-1,验证其巨噬细胞分型,并检测在添加PDTC或CCL5中和抗体处理后的分型变化;WB检测上述处理巨噬细胞中经典信号通路的变化;a PKCι介导的间充质样胆管癌细胞与THP-1细胞共培育以检测其对巨噬细胞的趋化作用,并用a PKCι-si RNA、PDTC及CCL5中和抗体处理后检测a PKCι、NF-κB及CCL5在招募巨噬细胞中的作用;用稳定过表达a PKCι的人胆管癌细胞系构建裸鼠皮下移植瘤模型,口饲给予CCL5受体抑制剂Maraviroc,检测皮下成瘤大小,并免疫组化检测巨噬细胞招募情况。结果:a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞高表达并分泌CCL5,PDTC能够减少CCL5表达;TGFβ1与TNFa均能增强荧光素酶实验中的相对荧光,而TGFβ1在TNFa刺激基础上能进一步增强荧光强度;用间充质样胆管癌细胞条件培养基孵育后,巨噬细胞以表达CD206与TGFβ1为主,WB显示巨噬细胞STAT3的磷酸化水平显着增加,而PDTC或抗CCL5处理则消除了上述效应;与THP-1共培养显示间充质样胆管癌细胞对巨噬细胞具有明显的招募作用,而a PKCι-si RNA、PDTC及CCL5中和抗体消除了这种作用。在体内,稳定过表达a PKCι人胆管癌细胞系构建的裸鼠成瘤模型中,CCL5受体抑制时移植瘤体积减小;IHC实验发现体内CCL5受体被抑制时肿瘤中招募巨噬细胞减少,P-a PKCι表达降低。结论:a PKCι通过NF-κB信号通路调节胆管癌EMT并诱导CCL5分泌;a PKCι介导的胆管癌间质表型细胞通过分泌CCL5招募并诱导巨噬细胞M2型极化;体内实验结合前期结果证实TAM与胆管癌细胞间形成正向环路促进肿瘤进展。第五部分纳米脂质体联合输运a PKCι-si RNA和吉西他滨对胆管癌治疗疗效研究目的:设计并制备共递送脂质体系统联合运输a PKCι-si RNA和吉西他滨,初步探讨两者在胆管癌中的协同抗肿瘤效应。方法:与同济医学院药学院合作,用薄膜分散水合方法合成Gemcitabine-L,带正电荷的脂质体通过静电相互作用按比例吸附带负电荷的a PKCι-si RNA形成Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L,并使用Zeta PALS测定物理化学表征;锚定非依赖实验检测相应药物对胆管癌转化生长的影响;体内构建裸鼠皮下移植瘤模型,定期注射不同制剂,检测各种制剂的抗肿瘤作用;免疫组化验证Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L对于a PKCι/NF-κB通路以及对TAM的影响。结果:成功制备共递送脂质体系统,体外实验证实Gemcitabine/a PKCι-si RNA-L相较于其他制剂明显抑制胆管癌转化生长;体内裸鼠成瘤模型中,共递送脂质体组相较于单药和单递送脂质体组明显抑制皮下移植瘤体积;免疫组化显示吉西他滨可诱导NF-κB活化及巨噬细胞聚集,而联合a PKCι-si RNA治疗则减弱上述效应。结论:纳米脂质体联合输运a PKCι-si RNA和吉西他滨具有良好的协同抗肿瘤作用,靶向a PKCι可抑制肿瘤生长并增强吉西他滨化疗敏感性。
李振凯,张炳远,代冬冬,高源,张宪祥,胡继霖,卢云[5]（2013）在《肝门部胆管癌神经浸润动物模型的建立》文中进行了进一步梳理目的建立肝门部胆管癌神经浸润裸鼠模型。方法将培养的胆管癌细胞系QBC939细胞接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠背部皮下原代胆管细胞癌动物模型,取原代肿瘤组织接种于裸鼠腹腔近肝脏处,建立腹腔二代移植瘤模型,成瘤后行种植瘤组织解剖学和病理学观察。结果肝门部胆管癌背部皮下原代种植瘤成瘤率为100%（5/5）,未见神经浸润;腹腔二代移植瘤成瘤率为45%（9/20）,神经浸润率为22%（2/9）,神经浸润模型成功率为10%（2/20）。病理学观察显示为瘤细胞大小不一,形态多样,不规则;细胞分化程度低,胞浆减少,细胞核大,异形性明显,大小不等,可见核分裂像;无明显腺管样结构。结论肝门部胆管癌细胞具有较强的神经浸润性,应用QBC939细胞系建立肝门部胆管癌神经浸润裸鼠模型为研究肝门部胆管癌神经浸润方式及生物学特性创建了良好的实验平台。
毛先海[6]（2012）在《Fascin基因在胆管癌中诱导上皮间叶样表型转化及相关信号通路的初步研究》文中认为第一章Fascin、E-cadherin、Vimentin在胆管癌组织中的表达及相关性研究目的探讨Fascin、E-cadherin、Vimentin在胆管癌组织中的表达,临床意义及三者之间的相关性方法应用免疫组化SABC法检测142例胆管癌及20例良性胆管组织中Fascin、E-cadherin、Vimentin表达情况。结果1.胆管癌Fascin阳性率显着高于对照组（P<0.01）。胆管癌E-cadherin胞膜缺失率显着高于对照组（P<0.01）,胆管癌中Vimentin膜阳性表达率显着高于对照组（P<0.01）,差异均有统计学意义；2. Fascin与胆管癌组织分化程度、门静脉侵润、淋巴结转移、脏器转移、术后生存率等因素有关（P<0.05）；E-cadherin蛋白缺失与患者肿瘤分化程度有关（P<0.05）；Vimentin表达与分化程度、门静脉侵犯、肝炎病毒携带以及术后生存率相关（P<0.05）；3.胆管癌中Fascin表达与E-cadherin表达呈负相关（r=-0.464,P<0.01）, Fascin表达与Vimentin表达呈正相关（r=0.313,P<0.01）,E-cadherin膜表达与Vimentin膜表达呈负相关（r=-0.241,P<0.01）。结论1.在胆管癌组织中Fascin呈阳性表达,E-cadherin呈现膜缺失,Vimentin呈阳性表达,提示与肿瘤的侵袭和转移有关,三者联合应用是预测胆管癌预后的有价值的分子生物学指标；2.胆管癌的中发生了上皮间叶表型样转化（epithelialto-mesenhymal transition, EMT）,并与其侵袭转移密切相关；3.胆管癌中,fascin表达上调可能诱导了EMT现象,从而促进胆管癌侵袭转移。第二章Fascin基因干扰慢病毒载体构建、包装及稳定转染胆管癌细胞系的建立目的运用RNA干扰技术建立fascin低表达的胆管癌细胞系方法1.实时定量PCR（RT-PCR）检测胆管癌细胞系（RBE, QBC939）中fascin表达量,根据结果选择最合适本实验细胞；2.设计合成4条fascin-siRNA靶序列,同时设计1条阴性对照序列,构建重组shRNA穿梭质粒,经阳性克隆测序结果分析鉴定后,将它们分别与包装质粒混合物共感染293T细胞,荧光法测定感染效率；3.选择感染效率最高1组慢病毒颗粒感染给胆管癌细胞；4.应用RT-PCR及western bolt检测各组细胞中fascin的表达水平。结果1. RT-PCR检测发现QBC939中fascin基因mRNA的相对含量较高,选择QBC939进行后续试验2.测序结果显示,4组慢病毒颗粒均通过检测,重组成功；3.荧光法测定发现QBC939细胞的感染效率均达到80%以上；4. RT-PCR及western blot检测发现,加RNAi靶点病毒感染的细胞组fascin基因的表达明显下降,其中KD2组效果最佳,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.本研究通过慢病毒载体构建及包装,内源性靶筛,病毒感染胆管癌细胞QBC939,成功构建了稳定fascin低表达胆管癌细胞,为进一步研究fascin在胆管癌中的作用奠定了基础；2.胆管癌细胞中,运用RNA干扰技术能沉默fascin基因。第三章RNA干扰沉默fascin表达对胆管癌细胞生物学行为的影响目的在胆管癌细胞中RNA干扰沉默fascin表达后,检测胆管癌细胞增殖及侵袭力的变化方法1.MTT检测RNA干扰沉默fascin表达前后增殖能力变化；2. Transwell实验检测RNA干扰沉默fascin表达前后侵袭力变化；3.细胞划痕实验检测RNA干扰沉默fascin表达前后转移能力变化。结果1.MTT检测发现RNA干扰沉默fascin表达后细胞生长的速度明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）)；2. Transwell实验检测RNA干扰沉默fascin表达后转移率显着下降,差异有统计学意义（p<0.05）；3.划痕实验可见RNA干扰沉默fascin表达后细胞迁移速率明显下降,差异有统计学意义（p<0.05）。结论1.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939增殖能力下降；2.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939侵袭能力下降；3.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939迁移能力下降。第四章Fascin基因对胆管癌EMT的作用及相关信号通路的探讨目的探讨fascin在胆管癌中是否诱导EMT及相关信号转导通路方法1. western blot检测E-cadherin、vimentin表达变化,判断fascin是否诱导EMT。2.运用免疫荧光分析P-catenin （Wnt通路调节物）在肿瘤细胞中的分布变化,western blot检测β-catenin在细胞核,细胞浆及细胞膜蛋白量的变化,同时western blot检测下游靶基因MMP7,cyclin D1表达变化,判断fascin是否作用于Wnt信号通路。结果1. western blot检测发现,RNA干扰fascin表达组中E-cad的表达明显高于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；2. western blot检测发现,RNA干扰fascin表达组中vimentin的表达明显低于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；3.免疫荧光分析发现P-catenin在细胞核的分布明显减少,而在胞浆及包膜中分布增加,同时western blot检测发现P-catenin在细胞核的蛋白量也减少,胞浆及包膜的蛋白量稍有增加,但总蛋白量无明显变化；4. Western blot检测发现,RNA干扰fascin低表达组中MMP7、 cyclin D1的表达均明显低于非特异性对照组及对照组,其差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.在胆管癌中的沉默Fascin基因表达导致E-cadherin表达上调、vimentin表达下降,提示fascin可诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化；2.在胆管癌中的沉默Fascin基因表达导致P-catenin在胞核及胞浆内的表达减少、在包膜的表达增加,而沉默fascin表达后E-cadherin的表达上调,提示fascin与P-catenin可能在包膜上竞争性与E-cadherin结合；3.在胆管癌中沉默fascin基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路下游指标MMP7及Cyclin D1表达下降、β-catenin在胞核中分布减少,提示Wnt/β-catenin信号通路是fascin诱导胆管癌EMT发生的重要信号通路。第五章Fascin基因对胆管癌裸鼠移植瘤增殖能力的影响目的建立胆管癌裸鼠移植瘤模型,观察fascin在体内对胆管癌增殖的影响方法1.采用皮下注射法建立胆管癌裸鼠移植瘤模型；2.分别使用fascin基因的干扰慢病毒（实验组）和阴性对照组病毒（非特异性对照组）、PBS（对照组）进行瘤体局部注射给药,观察移植瘤生长情况。3. Western blot检测三组中fascin, vimentin, E-cadherin的表达情况结果1.本实验成功建立裸鼠体内胆管癌皮下移植瘤模型；2.实验组肿瘤体积明显小于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；3. western blot检测发现,实验组中E-cad的表达明显高于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；4. western blot检测发现,实验组中vimentin的表达明显低于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；结论1.在体内试验中,fascin基因的干扰慢病毒能有效抑制胆管癌细胞QBC939移植瘤的生长；2.在体内实验中进一步证实fascin基因能诱导EMT发生。
胡晓莉,谭清和,王建红,苏小琴,季进锋[7]（2012）在《吉西他滨联合奥沙利铂对人胆管癌裸鼠移植瘤模型的药效实验研究》文中研究表明目的观察吉西他滨联合奥沙利铂对荷人胆管癌裸鼠移植瘤的治疗效果。方法培养人胆管癌裸鼠移植瘤模型,将49只荷人胆管癌裸鼠分成7组,每组7只,分别为空白对照组,奥沙利铂（A）组,吉西他滨（B）组,A+B组,2A+B组,A+2B组和2A+2B组,于分组当天腹腔注射奥沙利铂,第2天注射吉西他滨。给药剂量:奥沙利铂1.125mg/kg,吉西他滨50mg/kg,生理盐水0.3mL/只。第24天处死裸鼠后测量肿瘤标志物,进行移植瘤病理及流式细胞仪分析。治疗期间每周2次测量肿瘤直径,计算相对肿瘤增殖率。结果荷人胆管癌裸鼠移植瘤成瘤率100%。A、B组第24天相对肿瘤增殖率分别为39.78%和45.73%;2A+2B组相对肿瘤增殖率最低,为32.05%。治疗组与空白对照组相比,肿瘤标志物、病理分析及MTT分析均有显着差异。结论吉西他滨、奥沙利铂对荷人胆管癌裸鼠移植瘤有抑制作用,两药联合有助于提高疗效。
刘家宏[8]（2011）在《胆管癌细胞系QBC939裸鼠神经浸润模型的建立及5’-AMP对裸鼠胆管癌移植瘤作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的建立胆管癌细胞株QBC939裸鼠神经浸润模型,研究其稳定性和可重复性,探讨5’-AMP所致的生物学低温对胆管癌裸鼠移植瘤生长的影响及病理学改变。方法①复苏人胆管癌QBC939细胞并进行传代,培养足量胆管癌细胞后,接种入裸鼠背部皮下,建立人胆管癌QBC939细胞裸鼠原代移植瘤,然后将原代移植瘤组织接种于20只裸鼠腹腔。30天后处死腹腔传代移植瘤裸鼠,行种植瘤肿瘤组织解剖学和病理学检查,观察胆管周围神经浸润情况。②将前期制备的14只胆管癌成瘤裸鼠随机分成对照组和实验组,每组7只。实验组在腹腔内注射相关剂量的5’-AMP提纯物,对照组在腹腔内注射等量生理盐水,动态观测荷瘤裸鼠体温的变化曲线,第2天处死取瘤组织,监测指标：（1）HE染色,观察肿瘤坏死组织比例；（2）检测裸鼠血清肿瘤标志物CEA和CA19-9水平。结果1.背部原代移植瘤裸鼠接种5只,均有肿瘤生成,成瘤率为100%（5/5）；腹腔传代移植瘤裸鼠接种20只,腹腔成瘤9只,其中2只伴有胆管周围神经浸润,成瘤率为45%（9/20）,肿瘤胆管神经浸润率为22.2%（2/9）。2.3mg/g组裸鼠注射5’-AMP后平均于60 min体温为25℃时进入冬眠状态,平均于120 min降至最低,最低体温为22.0℃,持续约60 min,其后体温逐渐回升,于350 min左右体温基本恢复正常,第二天裸鼠全部存活,测体温平均36.3℃,生命体征平稳。3.5-AMP实验组肿瘤坏死组织平均百分比为（18.2±5.3）%,空白对照组肿瘤坏死组织平均百分比为（5.7±2.4）%,差异有统计学意义（P<0.05）。实验组血清CA19-9和CEA水平分别为（318.6±102.9）U/ml和（11.9±0.8）ng/ml,对照组血清CA19-9和CEA水平分别为（452.7±118.3）U/ml和（13.1±0.9）ng/m1,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.本实验建立的动物模型为胆管癌神经浸润模型,成功率10%,其病理学特征与人类胆管癌一致。2.3mg/g的浓度是5’-AMP是能导致动物体温最低的最佳浓度,且多在注射后120分钟使裸鼠达到最低体温。3.5’-AMP所致的生物学体温不仅仅对胆管癌裸鼠移植瘤,对于其他的移植瘤均有抑制作用。
李玉泽,任克,徐克[9]（2011）在《胆道肿瘤动物模型建立的研究现状》文中认为胆管癌是一种侵袭性很强的胆道恶性肿瘤,全世界的发病率和死亡率逐步增加。建立合适的胆管癌动物模型对胆管癌的早期诊断和治疗具有重要意义。本文就胆道肿瘤动物模型建立方法的现状进行综述。
黄发昆,石铮[10]（2010）在《索拉非尼对裸鼠胆管癌移植瘤淋巴管生成的影响》文中研究指明目的探讨索拉非尼对胆管癌移植瘤淋巴管生成的影响。方法对Bal B/c-nu裸鼠皮下接种胆管癌QBC939细胞,构建裸鼠移植瘤模型。成瘤后,随机将36只裸鼠分为对照组、索拉非尼30mg·kg-1·d-1组和索拉非尼60mg·kg-1·d-1组,每组12只,灌胃法连续给药6周,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况。以淋巴管内皮透明质酸盐受体1（LYVE-1）标记肿瘤周边淋巴管,并计数微淋巴管密度（LMVD）。以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肿瘤周边组织中血管内皮细胞生长因子受体3（VEGFR-3）mRNA的表达。结果索拉非尼能显着抑制胆管癌移植瘤的生长,索拉非尼30mg·kg-1·d-1组和60mg·kg-1·d-1组的抑瘤率分别为55.1%和67.9%。对照组、索拉非尼30mg·kg-1·d-1组和60mg·kg-1·d-1组裸鼠移植瘤周边组织的LMVD分别为11.75±3.19、6.84±2.18和5.03±1.91。对照组的LMVD明显高于两个用药组（P<0.01）。对照组、索拉非尼30mg·kg-1·d-1组和60mg·kg-1·d-1组裸鼠移植瘤周边组织中VEGFR-3 mRNA的相对表达量分别为2.158±0.312、1.027±0.144和0.736±0.149,对照组中VEGFR-3 mRNA的相对表达量明显高于两个用药组（P<0.05）。各组裸鼠胆管癌区域引流淋巴结中均未观察到胆管癌转移灶。结论索拉非尼能显着抑制胆管癌裸鼠移植瘤的生长。索拉非尼可能通过抑制胆管癌周边组织中VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3轴的表达,来降低LMVD。
二、人胆管癌裸鼠移植瘤2号模型的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人胆管癌裸鼠移植瘤2号模型的建立（论文提纲范文）
（1）细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 参考文献 |
| 第二章 CDK7抑制剂的抗胆管癌作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 THZ1抗胆管癌作用的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CDK7 抑制和ABT-263 协同抗胆管癌作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:胆管癌组织中Lnc-ATB/miR-200c的表达及临床意义 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌细胞中表达及功能 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴调控胆管癌生长和迁移的分子机制 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.实验结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分:Lnc-ATB/miR-200c信号轴在胆管癌体外移植瘤模型中的作用 |
| 一.实验材料 |
| 二.实验方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 五.小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分:全文总结 |
| 1.研究结论 |
| 2.本研究的创新性 |
| 3.研究不足和展望 |
| 综述 长链非编码RNA在恶性肿瘤诊治中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间的主要成果 |
| 致谢 |
（3）ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖与转移的作用与机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表（List of Abbreviations) |
| 前言 |
| 第一部分 ciRS-7与miRNA-7在胰腺癌组织中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 体外探讨ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 体内探讨ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖和转移的作用与机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 环状RNA对于肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
| 英文论文三 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）肿瘤相关巨噬细胞和胆管癌细胞相互作用促进胆管癌的发展及耐药（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞对吉西他滨化疗抵抗 |
| 1.1 .前言 |
| 1.2 .材料和方法 |
| 1.3 .结果 |
| 1.4 .讨论 |
| 第二部分 aPKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导胆管癌细胞耐药 |
| 2.1 .前言 |
| 2.2 .材料和方法 |
| 2.3 .结果 |
| 2.4 .讨论 |
| 第三部分 aPKCι/NF-κB信号通路介导肿瘤相关巨噬细胞诱导的胆管癌细胞上皮间质转化 |
| 3.1 .前言 |
| 3.2 .材料和方法 |
| 3.3 .结果 |
| 3.4 .讨论 |
| 第四部分 aPKCι介导的胆管癌间质表型细胞分泌CCL5 招募并诱导巨噬细胞M2 型极化 |
| 4.1 .前言 |
| 4.2 .材料和方法 |
| 4.3 .结果 |
| 4.4 .讨论 |
| 第五部分 纳米脂质体联合输运a PKCι-siRNA和吉西他滨对胆管癌治疗疗效研究 |
| 5.1 .前言 |
| 5.2 .材料和方法 |
| 5.3 .结果 |
| 5.4 .讨论 |
| 全文总结 |
| 全文总结示意图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 附录2 缩略词汇 |
| 致谢 |
（6）Fascin基因在胆管癌中诱导上皮间叶样表型转化及相关信号通路的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文主要英汉缩略名词对照表 |
| 前言 |
| 第一章 Fascin、E-cadherin、Vimentin在胆管癌组织中的表达及相关性研究 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二章 Fascin基因干扰慢病毒载体构建、包装及稳定转染胆管癌细胞系建立 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三章 RNA干扰沉默fascin表达对胆管癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第四章 Fascin在胆管癌EMT中的作用及信号通路研究 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第五章 Fascin基因对胆管癌裸鼠移植瘤增殖能力的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间主要成果 |
（7）吉西他滨联合奥沙利铂对人胆管癌裸鼠移植瘤模型的药效实验研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 人胆管癌细胞 (QBC939) 裸鼠模型的建立 |
| 1.2.2 实验分组 |
| 1.2.3 药效评估 |
| 1.2.4 形态学观察 |
| 1.2.5 肿瘤标志物检测 |
| 1.2.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 荷瘤鼠的一般情况 |
| 2.2 相对肿瘤增殖率的比较 |
| 2.3 形态学观察 |
| 2.3.1 对照组 |
| 2.3.2 实验组 |
| 2.4 肿瘤标志物检测 |
| 3 讨论 |
（8）胆管癌细胞系QBC939裸鼠神经浸润模型的建立及5’-AMP对裸鼠胆管癌移植瘤作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及配置 |
| 1.2 人胆管癌QBC939接种细胞的制备 |
| 1.3 胆管癌神经浸润模型建立 |
| 1.3.1 原代移植 |
| 1.3.2 传代移植 |
| 1.3.3 观察项目 |
| 1.4. 5'-AMP对人胆管癌QBC939细胞裸鼠移植瘤瘤体干扰实验 |
| 1.4.1 5'-AMP对裸鼠作用预实验 |
| 1.4.2 人胆管癌QBC939细胞裸鼠移植瘤瘤体干扰实验 |
| 1.4.3 观察项目 |
| 1.5 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 图片 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）胆道肿瘤动物模型建立的研究现状（论文提纲范文）
| 1 胆囊癌动物模型的建立方法 |
| 1.1 胆囊癌诱发模型 |
| 1.2 胆囊癌移植模型的建立方法 |
| 2 肝内外胆管癌动物模型的建立方法 |
| 2.1 肝内外胆管癌诱发模型 |
| 2.2 肝内外胆管癌移植模型 |
四、人胆管癌裸鼠移植瘤2号模型的建立（论文参考文献）
- [1]细胞周期蛋白依赖激酶7抑制剂的抗胆管癌作用机制和联合用药研究[D]. 黄天璐. 南京大学, 2020(04)
- [2]Lnc-ATB通过miR-200c相关信号通路调控胆管癌增殖及转移的机制研究[D]. 林海. 苏州大学, 2020(06)
- [3]ciRS-7通过miRNA-7调节EGFR/STAT3信号通路促进胰腺癌增殖与转移的作用与机制[D]. 刘磊. 山东大学, 2019(02)
- [4]肿瘤相关巨噬细胞和胆管癌细胞相互作用促进胆管癌的发展及耐药[D]. 杨涛. 华中科技大学, 2019(04)
- [5]肝门部胆管癌神经浸润动物模型的建立[J]. 李振凯,张炳远,代冬冬,高源,张宪祥,胡继霖,卢云. 中国普外基础与临床杂志, 2013(05)
- [6]Fascin基因在胆管癌中诱导上皮间叶样表型转化及相关信号通路的初步研究[D]. 毛先海. 中南大学, 2012(03)
- [7]吉西他滨联合奥沙利铂对人胆管癌裸鼠移植瘤模型的药效实验研究[J]. 胡晓莉,谭清和,王建红,苏小琴,季进锋. 中国肿瘤外科杂志, 2012(03)
- [8]胆管癌细胞系QBC939裸鼠神经浸润模型的建立及5’-AMP对裸鼠胆管癌移植瘤作用的实验研究[D]. 刘家宏. 青岛大学, 2011(06)
- [9]胆道肿瘤动物模型建立的研究现状[J]. 李玉泽,任克,徐克. 中国比较医学杂志, 2011(02)
- [10]索拉非尼对裸鼠胆管癌移植瘤淋巴管生成的影响[J]. 黄发昆,石铮. 中华肿瘤杂志, 2010(11)