一、扁桃酸对感染小鼠腹水中弓形虫速殖子超微结构的影响(论文文献综述)
司鸿飞[1](2018)在《抗弓形虫天然产物筛选与甘草查尔酮A抗虫研究》文中研究表明弓形虫是专性胞内寄生原虫,临床可以感染人及温血动物,并造成严重的公共健康问题。尽管弓形虫病对人和动物具有较大的威胁,并且已经造成严重的经济损失,但临床上的治疗手段仍然是有限的,并且存在不能根治和副作用较大的问题。天然化合物作为巨大的化合物库,是抗弓形虫药物新药研发的重要资源。本试验选取了一系列具有抗癌和抗寄生虫活性的中药的主要活性单体进行体外抗弓形虫活性筛选,并在体内和体外对筛选出的天然产物的药效进行系统性的评价,初步探索其抗弓形虫机理,为临床治疗与抗弓形虫药物的开发提供理论依据。首先采用MTT法,测定不同浓度下黄芩苷、汉黄芩苷、甘草苷、甘草查尔酮A、氢溴酸槟榔碱、川楝素、对叶百部碱、鸦胆子素D、绿原酸、L-扁桃酸和D-扁桃酸对HFF细胞的细胞毒性,找出对HFF细胞生存的最小抑制浓度(生存率>95%)。并在最小抑制浓度下,进行体外抗弓形虫活性筛选,通过Giemsa染色观察抗虫效果。细胞毒性试验结果显示:11种天然产物对HFF细胞生存最小抑制浓度分别为:黄芩苷200μg/mL,汉黄芩苷80μg/m L,甘草苷70μg/m L,甘草查尔酮A 10μg/m L,氢溴酸槟榔碱20μg/m L,川楝素5μg/m L,对叶百部碱40μg/m L,鸦胆子素D 1μg/m L,绿原酸400μg/m L,L-扁桃酸80μg/m L,D-扁桃酸80μg/m L。经初步抗虫活性筛选试验显示:11种天然产物中,甘草查尔酮A具有明显的抗弓形虫增殖的作用。为了确定甘草查尔酮A在培养基中的保留时间,采用高效液相色谱法对培养基中甘草查尔酮A浓度进行测定,并绘制药时曲线。结果表明,甘草查尔酮A在0.01-2.0μg/m L的浓度范围内,线性关系良好,且此方法的专属性好,回收率较高,精密度较好。测定甘草查尔酮A在培养基中的浓度随着时间逐渐下降,且在48 h时三个浓度(1.2μg/m L、1.0μg/m L、0.5μg/m L)的甘草查尔酮A均检测不到。为考察甘草查尔酮A对弓形虫速殖子入侵HFF细胞的影响。培养基中加入甘草查尔酮A后加入弓形虫速殖子孵育2 h,弃去药物培养基继续培养24 h,用Giemsa染色观察甘草查尔酮A对弓形虫入侵宿主细胞的影响,试验结果显示甘草查尔酮的浓度高于1μg/m L时,可以完全抑制虫体的入侵,并呈剂量依赖。为确定甘草查尔酮A的抗虫体增殖效果和准确测定对虫体增殖的IC50,首先,建立了用荧光定量PCR评价虫体荷载量的方法,并采用此方法对不同浓度的甘草查尔酮A作用下的虫体荷载量进行测定,计算甘草查尔酮A对弓形虫的IC50。同时,用Giemsa染色法观察不同浓度的甘草查尔酮A对弓形虫增殖的影响。结果显示,建立的评价虫体荷载量的荧光定量PCR的方法精密度和回收率的RSD值均小于5。Giemsa染色表明:随着甘草查尔酮A的浓度的升高,处理孔内的包囊数,速殖子数,和纳虫囊泡内的平均虫体数均降低呈剂量依赖。用荧光定量PCR测定在各个甘草查尔酮A浓度下的虫体荷载量,结果与Giemsa染色结果一致,并且通过计算得出,甘草查尔酮A对弓形虫速殖子的半数抑制浓度IC50值为0.848μg/mL。为探究甘草查尔酮A抑制虫体增殖的机制,采用扫描电镜和透射电镜观察甘草查尔酮A对弓形虫的超微结构的影响,随后采用尼罗红染色,用激光共聚焦显微镜观察脂质富集,并用流式细胞仪对荧光强度进行测定。扫描电镜显示:不同浓度处理后弓形虫速殖子变小变圆,表面出现凹陷,并且浓度越大越明显。透射电镜结果显示:同一浓度处理下,速殖子内部出现脂体,并且随着时间的延长脂体逐渐增多,各个细胞器的膜结构消失,最终虫体死亡。尼罗红染色证明了这一现象,可以观察到中性脂类在虫体内蓄积的情况,并随着时间的延长积累加剧。表明甘草查尔酮A是通过干扰脂代谢而引起虫体死亡。在体内,首先确定口服和腹腔注射的最大安全给药剂量和给药次数。建立体内弓形虫急性感染模型,采用口服和腹腔注射两种方式对不同浓度甘草查尔酮A的体内抗虫效果进行评价。口服甘草查尔酮A最大剂量达到1000 mg/kg没有出现不良反应,在腹腔注射时剂量达到为386 mg/kg.bw时,小鼠出现死亡。24 h内腹腔注射3次,给药在达到1000mg/m L时未发现死亡现象。在小鼠急性感染模型治疗实验中,低剂量腹腔注射组存活率为80%,中剂量腹腔注射组存活率为90%,高剂量腹腔注射组的存活率为100%,口服各剂量组没有改变死亡的结局,但平均存活时间均有延长,但各剂量组之间没有显着差异。安全性实验结果显示,在此给药方式下各组小鼠均无死亡,采取各器官,切片做HE染色均无发现异常。终上所述:甘草查尔酮A可以抑制弓形虫速殖子的入侵和复制,提高感染小鼠的生存率,超微结构观察显示,甘草查尔酮A的抗虫机制与脂代谢相关。本试验结果表明甘草查尔酮A是潜在的抗弓形虫化合物,有望开发成为抗弓形虫药物。
郑玉香[2](2018)在《弓形虫慢性感染导致雄性小鼠生殖障碍及蛋白互作的初步研究》文中指出弓形虫(Toxoplasma gondii)是细胞内寄生原虫,广泛寄生于人和其他温血动物体内。弓形虫感染宿主动物后,很少见急性感染或死亡现象,而是转为没有明显临床症状的慢性感染状态。弓形虫慢性感染可引起弓形虫脑病、孕妇妊娠不良及雄性生殖障碍。在雄性生殖中,包括细胞和组织损伤:生殖细胞周期紊乱、生精迟缓或停止、精子参数变化、睾丸和附睾组织重量减轻、细胞层次紊乱不规整等,但是目前对弓形虫与生殖系统间的互作机制还没有明确的结论。为了研究弓形虫II型虫株Prugniaud(PRU)感染昆明小鼠对其睾丸中精子发生及附睾中精子成熟相关基因表达水平的影响,我们建立弓形虫慢性感染小鼠模型,统计子代小鼠生殖参数,结果显示弓形虫感染后精子畸形率升高,精子数量及存活率下降;子代小鼠出生率降低,42.85%子代小鼠为先天性弓形虫感染者。用RNA-seq Sequencing(RNA-seq)技术对两个组织的弓形虫感染组和对照组进行测序,睾丸组与附睾组分别有250和418个基因在表达水平上存在显着差异(P<0.05,|log2fold change|≥1),对两组数据进行聚集后有42个基因是共同差异表达的。对差异表达基因(DEGs)进行生物信息学分析,Gene ontology(GO)富集发现睾丸组与附睾组数据中注释到GO数据库的DEGs分别有1696、3806个。通过KEGG通路分析以便更好地理解DEGs的生物学功能,睾丸组数据中注释到KEGG通路的DEGs总共有48个,富集在70条通路中;在附睾组数据中注释到KEGG通路的DEGs有136个,这些基因富集在100条通路中。其中,吞噬体、细胞黏附分子和抗原加工与递呈通路是弓形虫慢性感染后DEGs最多的通路,糖酵解通路中关键酶的失调表达影响精子活力,花生四烯酸代谢通路中的PTGDS基因表达在生精细胞、支持细胞及间质细胞中,对血睾屏障(Blood-Testis Barrier,BTB)的形成与维持有重要作用,通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-ip)实验将PTGDS的抗体与弓形虫蛋白互作,分析与PTGDS互作的弓形虫蛋白。结果显示共筛出134个弓形虫蛋白,其中,有41个未知蛋白,有25个蛋白参与KEGG通路注释,经过对通路和蛋白进行分析,发现弓形虫核糖体蛋白(包括RPL4,RPSA,RPL37,RPL6,RPL18A)可能对虫体的入侵、复制及裂解宿主细胞发挥重要作用,代谢通路中SDH和GAPDH蛋白可能参与能量供应的同时还与虫体入侵靶细胞的过程相关,可进行进一步研究。实验中将二代高通量转录组测序技术用于弓形虫感染睾丸和附睾组织的测序并获得DEGs,通过Co-ip与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)找出与PTGDS蛋白互作的弓形虫蛋白,为后续研究弓形虫感染引起生殖障碍的机理奠定基础。
张晓川[3](2016)在《苦参生物碱类成分抗弓形虫作用的研究》文中指出目的:弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种人兽共患传染病,在全球范围内传播广泛,严重危害人类的健康和畜牧业的发展。虽然传统的弓形虫病治疗药物可以在一定程度上抑制或杀灭弓形虫虫体,但同时也会对机体产生许多的毒副作用。本研究中,我们对三种主要的苦参生物碱类活性成分的抗弓形虫作用效果进行了评估,希望能在植物药资源中找到具有抗弓形虫作用且较低毒性的活性成分,以期为弓形虫病的中药治疗提供新的理论依据。方法:本研究我们充分利用体外细胞增殖实验和体内小鼠感染模型实验,对受试化合物的抗弓形虫作用及其对宿主的保护作用进行了评价。在体外实验中,我们利用CCK-8实验分析了受试药物的细胞毒性及其对弓形虫作用的选择性,通过显微图像直接观察药物治疗后感染细胞的形态变化,并通过台盼蓝染色实验检测各实验组的活细胞比例。在体内实验中,我们用弓形虫RH株感染白色雌性昆明小鼠来构建急性弓形虫感染动物模型,每日灌胃给药,4天后计数小鼠腹腔内弓形虫数目,分析小鼠肝脾指数,同时检测小鼠肝脏中ALT、AST、GSH和MDA的含量,并进一步观察小鼠15天内的死亡情况。结果:体外结果显示,受试药物对HeLa细胞的生长抑制作用与给药剂量有关,呈浓度依赖型,其中,氧化苦参碱和苦参碱抗弓形虫作用的选择性要明显优于槐果碱和螺旋霉素。氧化苦参碱和苦参碱不仅使细胞外弓形虫数量显着降低,同时也改善了被感染细胞的生长状态,增加了细胞的存活数量。体内结果显示,氧化苦参碱和苦参碱均能有效抑制小鼠腹腔内弓形虫的增殖,其治疗效果与高剂量下的螺旋霉素相当。而且,与螺旋霉素相比,两者能维持肝脏和脾脏正常的相对重量,能有效降低被感染小鼠血清内ALT和AST的含量,同时能修复因弓形虫感染所带来的肝脏GSH和MDA含量的变化。此外,经氧化苦参碱和苦参碱治疗后的小鼠存活率也优于螺旋霉素治疗组。结论:本次研究首次证明了氧化苦参碱和苦参碱在体内外具有低毒、高效的抗弓形虫活性,且相比于螺旋霉素,它们对弓形虫感染所引起的肝损伤均起到很好的保护作用。氧化苦参碱和苦参碱有望成为新型弓形虫病治疗药物的候选药物。
吴升伟,王正蓉,包怀恩[4](2015)在《氟康唑抗弓形虫速殖子作用的超微结构观察》文中指出为探讨氟康唑在体外杀灭弓形虫速殖子的效果,抽取感染弓形虫RH株速殖子小鼠腹水,选择活跃的速殖子并稀释至含虫密度为1×105个/m L,加入氟康唑溶液使其终浓度为1.5 mg/m L,以未加药物的相同腹水作阴性对照,加入阿奇霉素的作为阳性对照。应用透射电镜观察药物作用1小时、4小时时虫体超微结构的变化并拍照。结果表明:随着氟康唑作用时间的延长,弓形虫速殖子超微结构逐渐遭到破坏,细胞内容物外溢,最终崩解死亡。相同时间内阿奇霉素作用的速殖子出现细胞膜结构受损,速殖子从头、尾两端开始断裂。说明氟康唑在体外可以杀死弓形虫速殖子,达到了和阿奇霉素一样的效果,且效果与时间有关。
曾艳波,董辉,韩红玉,姜连连,赵其平,朱顺海,马卫娇,程军,黄兵[5](2012)在《磺胺氯吡嗪对弓形虫速殖子超微结构的影响》文中研究说明为了探索磺胺氯吡嗪抗弓形虫作用机制,观察该药对弓形虫速殖子超微结构的影响。分别用PBS和磺胺氯吡嗪PBS溶液(250mg/mL)浸泡弓形虫RH株速殖子,在37℃恒温箱中孵育2h后,经固定、脱水、置换、喷金或包埋、聚合、修块、切片、染色等过程,用扫描电镜和透射电镜观察两种溶液处理弓形虫速殖子后的超微结构变化。扫描电镜图片显示PBS处理的速殖子大小均匀,表面完整、光滑;而经磺胺氯吡嗪处理的速殖子大小不均,表面凹凸不平,部分虫体出现破损、崩解等。透射电镜图片显示PBS处理的速殖子细胞膜与核膜清晰完整,细胞核呈椭圆形,类锥体和微线体排列有序;经磺胺氯吡嗪处理的速殖子细胞膜和核膜破损,细胞质中出现空泡,致密斑颗粒明显减少,类锥体和微线体模糊不清。磺胺氯吡嗪能引起弓形虫速殖子外部形态与内部结构发生改变,对细胞器造成损伤,从而阻碍了虫体的发育与繁殖。
赵光伟[6](2012)在《四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究》文中研究说明弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病,在世界上分布广泛,大约有25%-50%的人受到感染。弓形虫的宿主非常广泛,猫科动物是其唯一的终末宿主,绝大多数温血动物均可作为该病原的中间宿主,然而不同宿主对弓形虫的易感性及转归均有不同。小鼠对其极为敏感,可引起急性的致死性感染因而常常作为弓形虫急性感染的动物模型;而鸡由于对弓形虫的感染不表现任何临床症状,被认为是不敏感的中间宿主。为了探寻这两种动物感染弓形虫后免疫病理学变化的差异,同时针对同一宿主对不同动物来源的弓形虫虫株感染后的免疫病理变化进行比较研究,特进行了如下工作:1.猫源弓形虫虫株的分离及其与鸡源、猪源和人源虫株基因型的鉴定对江苏南京地区11只家猫进行弓形虫抗体IgG的检测,筛选抗体阳性猫进行虫株的分离。利用盐酸-胃蛋白酶消化法处理阳性猫的心、脑、舌等组织,制成组织悬液腹腔接种小鼠,通过连续传代,分离到2株弓形虫虫株,分别命名为CAT2和CAT3。进而利用PCR-RFLP方法,对分离到的猫源虫株以及实验室保存的鸡源(JS)、猪源(CN)和人源(RH)共5株弓形虫虫株进行了基因型的鉴定,通过对7个等位基因5’-SAG2,3’-SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, cB21-4和L358的扩增和酶切,证明此5株弓形虫虫株均为基因Ⅰ型。2.四种不同来源弓形虫虫株对小鼠和鸡致病力的比较小鼠对弓形虫非常敏感,而鸡通常不敏感。本研究对四种不同来源的5个虫株RH, CN, JS, CAT2和CAT3对鸡和小鼠的致病力分别进行比较,同时建立弓形虫感染雏鸡的动物模型。210只10日龄雏鸡分为21个组,每组10只,5个虫株RH,CN,JS,CAT2和CAT3按照5×108,1×108,1×107,和1×106不同剂量腹腔感染10日龄雏鸡,同时设阴性对照组,仅注射生理盐水;感染后每日观察实验鸡的临床症状,逐只测量直肠温度,记录每组鸡的死亡情况;利用PCR方法对53天未死亡的鸡进行检测,对急性死亡和53天未死亡的鸡进行病理组织切片,观察病理变化。对小鼠致病力的对比试验选用腹腔感染和灌胃感染两种途径,分别选用260只ICR小鼠,随机分为26个组,每组10只,按照不同的虫株选择1×105,1×104,1×103,1×102和1×101剂量进行感染,记录每只小鼠的存活时间;根据实验动物的存活时间对5个虫株的致病力进行比较。结果发现RH,CN, CAT2和CAT3四个虫株对小鼠和鸡的致病力无显着差异,而JS株对小鼠的致病力较弱,但对鸡的致病力较强,这说明虫株的来源对弓形虫的致病性具有重要的影响。同时发现1×107剂量的速殖子腹腔感染10日龄雏鸡,既能产生适度的临床症状,又能够使实验动物避免死亡,可作为弓形虫体内感染雏鸡的动物模型。综合考虑小鼠的感染率、存活时间以及感染过程中的偶然因素,发现1×102腹腔感染和1×104灌胃感染是小鼠模型的最佳感染剂量。3.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。200只小鼠(18。22g)随机分成5个组,每组40只,分别命名为JS, CAT, CN, RH和阴性对照组,四个虫株JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×102的剂量腹腔感染小鼠,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,3天,6天和8天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体(IgA,IgG, IgM和IgG的亚型IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3)利用ELISA方法进行检测;脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测;细胞因子IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测;血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天能够检测到IgM并持续至第8天;感染后第8天能检测到IgA,而IgG及其亚型均未检测到;CD4+, CD8+T和NK细胞分别在第6天、第3天和第3天显着上升,均在第8天时显着下降,在此时间点仅CN组CD4+T细胞显着高于阴性对照组,4个感染组CD8+T细胞虽下降但仍显着高于阴性对照组,RH、CN和CAT组NK细胞显着高于阴性对照组;MHC Ⅰ分子第6天显着上升但在第8天时下降,仅CAT组显着高于阴性对照组;MHC Ⅱ分子从第3天显着下降并持续至第8天仍显着低于阴性对照组;IFN-γ和IL-12在第6天显着上升均在第8天时下降,4个感染组IFN-γ在第8天仍显着高于阴性对照组,但JS组IL-12与阴性对照组无差异;IL-10和IL-4在第3天显着上升均在第6天时显着下降,4个感染组IL-10仍显着高于阴性对照组,但IL-4与阴性对照组无差异;IL-17在第6天显着上升并持续至第8天仍高于阴性对照组;感染后第3天可检测到高浓度的NO、血清铁以及高活力的iNOS,均在第6天达到最高峰而后下降,第8天时,仅CAT组NO显着高于阴性对照组,4个感染组的iNOS与阴性对照组之间差异不显着,但血清铁仍显着高于阴性对照组。这些结果反应了小鼠抗弓形虫腹腔感染而引起的免疫病理学变化,而不同来源虫株之间存在的差异可能与虫株的生物学特性有关,说明虫株的来源对弓形虫免疫病理变化也具有重要的影响。4.四种不同来源弓形虫虫株灌胃感染小鼠免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株灌胃感染小鼠,对小鼠感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。250只小鼠(18-22g)随机分成5个组,每组50只,分别命名为JS、CAT、CN、RH和阴性对照组,四个虫株JS、XAT、CN和RH的速殖子按1×104的剂量灌胃感染小鼠,阴性对照组仅灌服等量PBS。感染后分别在第0天,3天,6天,8天和10天采血和脾脏用于分离血清和脾脏淋巴细胞,每组10只。弓形虫循环抗原和特异性抗体(IgA、IgG、IgM和IgG的亚型IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)利用ELISA方法进行检测;脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T细胞和NK细胞以及MHCI和MHCⅡ类分子的变化利用流式技术进行检测;细胞因子IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测;血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测。感染后第6天TCA阳性并持续至第10天;第10天时IgG显着上升并以IgG2a和IgG2b为主;IgA和IgM第6天时显着上升并持续至第10天;CD4+和CD8+T细胞第6天时开始显着上升,第8天达到高峰,各组CD4+T细胞在第10天下降,与阴性对照组无差异,而CD8+T细胞虽下降,但CN、CAT和JS仍显着高于阴性对照组;弓形虫感染后第3天,JS和CAT组NK细胞水平显着上升,第8天时,四个感染组均上升并持续至第10天;CAT组MHCI水平第3天显着上升,其余三个感染组无显着变化,第8天,四个感染组均显着上升,第10天时开始下降,但除JS组外,其余三个感染组仍显着高于阴性对照组;MHC Ⅱ分子在第3天显着下降并持续至第10天;感染后第6天,JS和CAT感染组组IFN-γ显着上升,第8天时,RH、CN和JS三个组显着上升,但CAT组下降,第10天时4个感染组均下降与阴性对照组无差异;RH和CAT组IL-12在感染后第3天显着上升,第6天时四个感染组均显着上升并持续至第8天,第10天时开始下降仅CAT组显着高于阴性对照组;RH和CAT组IL-4仅在第6天时显着上升;CN、JS和CAT组IL-17在第8天时显着上升而后开始下降,第10天时仅JS组显着高于阴性对照组;NO、血清铁和iNOS勺活力均在第3天开始显着上升并持续至第8天,第10天时下降与阴性对照组之间无差异。这些结果反应了小鼠弓形虫灌胃感染所引起的免疫病理变化。与腹腔感染小鼠相比,较晚出现的TCA,较早出现并且较高滴度的IgA以及产生的IgG说明腹腔感染和灌胃感染两种不同的感染途径影响免疫病理变化的产生。5.四种不同来源弓形虫虫株腹腔感染鸡免疫病理变化的比较本实验将JS、CAT、CN和RH弓形虫虫株腹腔感染雏鸡,对鸡感染弓形虫后的免疫病理变化进行比较。300只10日龄雏鸡随机分成5个组,每组60只,分别命名为JS,CAT, CN, RH和阴性对照组,JS、CAT、CN和RH的速殖子按1×107的剂量腹腔感染雏鸡,阴性对照组仅注射PBS。感染后分别在第0天,4天,11天,25天,39天和53天采血和脾脏,分离血清和脾脏淋巴细胞,每组取10只。弓形虫循环抗原和特异性的抗体(IgA,IgG和IgM)利用ELISA方法进行检测;脾脏淋巴细胞中CD4+,CD8+以及MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子的变化利用流式技术进行检测;细胞因子IFN-γ,IL-12,IL-4,IL-10和IL-17利用ELISA方法进行检测;血清铁、血清中NO和iNOS的活性利用比色法进行检测;血细胞包括中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞利用血细胞分析仪直接测定。感染组高水平的IgM,IgG和IgA分别在感染后第4天,第11天和第11天出现,并持续至39、53和39天;不同感染组CD4+T细胞分别在第4天和第11天显着上升,至53天时与阴性对照组无显着差异;CD8+T细胞和MHC Ⅰ类分子在第4天显着上升,至53天时,CD8+T细胞仍显着高于阴性对照组,而MHC Ⅰ类分子在39天时与阴性对照组差异不显着;MHC Ⅱ类分子在第4天显着上升又在25天时显着下降,至53天时与阴性对照组差异不显着;IFN-γ, IL-12, IL-10和IL-17分别在感染后第4天显着上升,25天时,感染组IFN-γ和IL-10与阴性对照组差异不显着,而感染组IL-12至53天时仍显着高于阴性对照组,IL-17则无显着差异;4个感染组IL-4自始至终均无显着变化;感染组NO,血清铁以及iNOS的活力在第4天显着上升,又在第39天后与阴性对照组无显着差异。这些都反应了鸡感染弓形虫后的免疫病理学变化。与另外三个感染组相比,JS组具有更高水平的CD4+, CD8+T细胞,IFN-γ, IL-12, IL-10,NO和更高活力的iNOS,这说明其差异可能与虫株的来源有关。与腹腔感染小鼠的结果相比,IgG抗体的产生,感染早期显着上升的MHC Ⅱ,较早产生的IFN-γ, IL-12和IL-17以及无显着变化的IL-4有可能是造成鸡和小鼠对弓形虫易感性差异的原因,其确切机制仍需进一步研究。
曾艳波[7](2011)在《急性弓形虫小鼠感染模型的建立与抗动物弓形虫病药物的初步筛选》文中研究指明弓形虫病是一种重要的机会致病性人兽共患寄生虫病,能在人和多种哺乳动物之间传播。动物感染后不但会影响生产性能,还将会成为人类弓形虫病的传染源,因此,对该病的防治具有重要的经济学价值和公共卫生学意义。本研究通过建立急性弓形虫小鼠感染模型后,进行抗弓形虫药物的筛选,拟发现用于动物弓形虫病防治的药物,并对有效药物的抗虫机制进行初步研究,为临床上用于治疗动物弓形虫病提供理论依据。1.弓形虫复苏方法及虫体毒力的摸索及急性弓形虫小鼠感染模型的建立通过对弓形虫株经不同保存时间及复苏条件后对小鼠致病性的研究,评价虫体保存方法。使用液氮冻存和体内传代法,摸索出了得到毒力稳定的虫体最佳保存时间、复苏代次与接种剂量。在此基础上,确立了急性弓形虫小鼠感染模型:使用本实验室保存半年以内的弓形虫RH虫株速殖子,经小鼠体内传代2次后,腹腔接种超过4 000个虫体/鼠/0.2 mL(KM系、体重20-24 g),将保证所有小鼠在6-10 d内全部死亡。通过模型的建立,为后续弓形虫虫体生物学和药物筛选研究奠定了基础。2.抗弓形虫病药物筛选的研究鉴于目前无专用于动物的抗弓形虫病药物,本研究拟通过选用11种已用于抗动物其它原虫病及其病原微生物的药物,来进行抗弓形虫病的研究。发现原用于抗动物球虫病的药物—磺胺氯吡嗪具有很好的抗弓形虫效果,能明显减少弓形虫在小鼠体内的生长、繁殖,可保护50%以上的小鼠免于死亡并长时间存活,并无法检测到虫体。3.磺胺氯吡嗪对弓形虫速殖子超微结构的影响弓形虫速殖子经磺胺氯吡嗪溶液处理后,通过扫描电镜与透射电镜观察虫体结构的变化。在扫描电镜下,药物处理后的虫体大小不均,细胞膜凹凸不平、皱缩呈现不完整,部分虫体出现破损、崩解,虫体反光度不均一等。在透射电镜下,药物处理后,部分虫体发生崩解,虫体细胞膜和核膜结构损坏;致密斑颗粒数量明显减少,细胞质发生均质样改变,细胞质中出现许多空泡;细胞核发生异染色质化,染色质边缘与核膜分离并出现空泡;顶端类锥体结构模糊,出现类似多细胞生物的凋亡特征。4.磺胺氯吡嗪处理前后弓形虫速殖子消减文库的构建以正常弓形虫速殖子cDNA作为Driver(驱动组),分别以磺胺氯吡嗪、磺胺嘧啶+乙胺嘧啶处理速殖子cDNA作为Tester(实验组),构建了2个消减文库(T1-1、T2-1),经鉴定文库重组率超过85%,片段长度大小不一,均在250750 bp范围内,后续基因功能分析有待进一步研究。
荆振宇[8](2011)在《基于rROP18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究》文中研究说明弓形虫病是一种全球分布且危害严重的人畜共患病,人和几乎所有的温血动物均能感染弓形虫,成年人多为隐性感染,孕妇感染后可导致流产、弱胎或死胎。此外,该病也严重危害受孕家畜的生产,给畜牧业造成严重的经济损失。因此,建立一套科学的诊断方法和有效的治疗措施至关重要。弓形虫表面蛋白(SAG1和SAG2)和棒状蛋白被认为是弓形虫病诊断和疫苗研究具有极大优势的两种候选分子。ROP18是弓形虫在速殖子、缓殖子都表达的蛋白,具有激酶活性的丝氨酸-苏氨酸激酶,并有免疫原性,关于其研究,目前国内外报道极少。本研究根据已知基因序列设计引物,以提取弓形虫RH株的总DNA为模板,通过PCR技术扩增rop18的主要基因,将截断的rop18基因连接到原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-rop18,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,融合蛋白以包涵体形式表达,复性后表达产物经western-blot分析,对慢性感染的血清有良好的免疫反应原性,利用重组蛋白rSAG2和rROP18,初步建立检测犬弓形虫病ELISA检测方法,对弓形虫不同时期(急性、慢性)血清中抗体均能检出,对72份犬血清进行检测,结果阳性率为12.5%,与IHA阳性符合率为85.7%,阴性符合率为95.4%。目前弓形虫病的防治还依赖于药物,由于抗弓形虫公认有效的治疗药物的用药时间长,毒副作用较大,加上缺乏动物专用抗弓形虫药物,因此需要寻找一种高效、低毒专用于动物的抗弓形虫药物迫在眉睫,中药不但具有低毒性、低残留的优点,还可以提高动物机体免疫力和降热等疗效。为此,本研究试图筛选抗弓形虫病的中西药,利用西药快速有效的作用,结合中药清热、调节机体、低毒副的作用共同进行弓形虫病的治疗。采用体外试验,培养Ana-1细胞作为弓形虫宿主细胞,采用MTT法测定药物对细胞的安全浓度,将弓形虫RH株速殖子与Ana-1细胞在含不同浓度药物的细胞培养液中共同培养,在加药后4,8,12,24,48小时,观察细胞和弓形虫生长状态和形态,选取48小时观察药物体外抑制虫体增殖的效果,结果发现磺胺氯丙嗪钠比磺胺嘧啶钠有更好抑制效果,甘草、百部和黄芩的可显着抑制弓形虫增殖。对拟用于抗弓形虫组方的药经KM小鼠体内抗弓形虫效果的验证,结果表明甘草、黄芩能够明显延长小鼠的存活时间,磺胺氯丙嗪钠能使50%的弓形虫小鼠存活,该药配伍黄芩和甘草两种中药形成复方药物,小鼠体内抗弓形虫试验结果提示中西药复方制剂能在保持疗效的基础上减少西药用量。抗弓形虫药物组方磺胺氯丙嗪钠联合黄芩和甘草在人工感染40日龄上长猪体内临床抗弓形虫初步试验,表明:组方治疗猪弓形虫病后,发热症状控制较快;血液中带虫天数,血清循环抗原(CAg)峰值低于感染对照组;虫血症和血清CAg转阴速度比感染对照组快;验证磺胺氯丙嗪钠组方能有效治疗猪的弓形虫病,在推荐的使用剂量下,安全,无明显毒副作用。
朱穗京,田春林,杨雯[9](2009)在《抗弓形虫药物研究新进展》文中进行了进一步梳理弓形虫是重要的机会性感染病原体,可导致人兽共患弓形虫病,目前尚未找到理想的治疗药物。本文综述了抗生素类药物、其它类化学药物、生物制剂及中药抗弓形虫作用的最新研究进展,对抗弓形虫药进行了总结。其中复方中药在治疗急性弓形虫病有很大的应用价值,西药联合用药,可适当减少药量、降低不良反应和耐药性的产生,治疗效果明显优于单独用药。
张东林[10](2008)在《弓形虫病分子诊断方法及弓形虫分离株耐药性的研究》文中提出弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的以孕妇(畜)流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童(幼畜)生长受阻、死亡等为特征的人畜共患病。该病广泛存在于世界各地,宿主范围十分广泛,人及大多数动物感染率都较高,是人类优生的大敌,是当今新生儿致畸的四大病因之一。弓形虫病在猪场感染率高,严重影响着养猪业的发展。建立准确快速的诊断方法和研制安全高效疫苗是预防和控制弓形虫病的重要措施。MIC3是弓形虫在速殖子、缓殖子及子孢子期都表达的粘附蛋白,与弓形虫入侵宿主细胞密切相关,已证明其具有良好的免疫原性。本研究利用原核表达的弓形虫微线体蛋白3(MIC3)建立了SPA-ELISA和AG-ELISA检测方法,利用细胞培养方法从临床血清学阳性的病料中分离得到了10株弓形虫虫株,并对虫株的耐药性进行了研究。主要研究成果如下:本研究利用本室构建的pGEX-KG-MIC3质粒转化感受态细胞,确定了pGEX-KG-MIC3在E.coli BL21-CodonPlus菌株中高效表达的最佳条件,SDS-PAGE实验表明表达的融合蛋白分子量为66KD,表达产物经Western blot检测证实具有较强的免疫反应原性。利用纯化的重组蛋白rMIC3替代传统的虫体成份作为诊断抗原建立了SPA-ELISA和AG-ELISA诊断方法。这两种方法检测猪其它常见病原体阳性血清,结果全为阴性;SPA-ELISA和AG-ELISA分别能检测到1:6400和1:12800稀释血清中的抗T.gondii特异性抗体;诊断试剂的批内(间)重复试验,ELISA变异系数<10%;在4℃贮存下诊断试剂的保质期均超过8个月。结果表明,本研究建立的两种诊断方法均具有良好的特异性、敏感性、稳定性及较长的保质期。为验证和比较SPA-ELISA和AG-ELISA的广适性,在临床上,检测了四种不同动物血清,共332份,并与MAT方法进行了比较,结果表明,除山羊血清外,SPA-ELISA对猪、犬、猫血清的阳性检出率均高于MAT方法,二者符合率超过90%。利用AG-ELISA检测四种动物血清,共304份,并与MAT方法进行比较,结果显示,AG-ELISA对四种动物血清的阳性检出率均高于MAT方法。说明了AG-ELISA具有更广泛的宿主适用范围。为进一步验证AG-ELISA的实际应用效果,利用已建立的AG-ELISA监测了人工感染弓形虫猪体内抗体水平的动态变化,同时用MAT方法及ELISAkit平行测定。结果表明,首次感染第10d,8头人工感染猪的AG-ELISA抗体均为阳性,第35d,AG-ELISA抗体水平达到高峰,随后缓慢下降,在第57d时仍可检测到ELISA抗体。Kappa一致性试验结果表明,AG-ELISA与MAT方法及ELISAkit符合良好。为提高弓形虫细胞分离的阳性率,对细胞培养条件进行了优化,结果显示,细胞培养的最佳条件为选用DMEM高糖培养基,加入1%血清和10%SRC。采集猪的抗凝全血,利用细胞培养方法进行了弓形虫虫株的分离。利用上述培养条件,对19份弓形虫AG-ELISA抗体阳性的抗凝血进行了弓形虫虫株的分离培养,经显微镜观察、PCR检测以及动物接种试验证明,成功地分离得到10株弓形虫分离株。耐药性试验初步显示其中的一株对磺胺类药物具有一定的抗药性。本研究建立的SPA-ELISA和AG-ELISA诊断方法,解决了目前弓形虫病不易快速、准确、简便诊断的难题,对多种动物弓形虫病的临床诊断、疾病控制等均具有重要意义。猪源弓形虫虫株的分离及磺胺耐药现象的初步证实,为弓形虫病的有效防治及合理用药奠定了基础。
二、扁桃酸对感染小鼠腹水中弓形虫速殖子超微结构的影响(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、扁桃酸对感染小鼠腹水中弓形虫速殖子超微结构的影响(论文提纲范文)
(1)抗弓形虫天然产物筛选与甘草查尔酮A抗虫研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 文献综述 |
1.1 弓形虫概述 |
1.1.1 弓形虫的生物学特征 |
1.1.2 弓形虫虫株的多样性 |
1.2 弓形虫病的流行及危害 |
1.2.1 流行特点 |
1.2.2 诊断 |
1.2.3 治疗 |
1.3 抗弓形虫药物的研究进展 |
1.3.1 化学合成类药物 |
1.3.2 天然产物类 |
1.4 本课题的意义 |
第二章 抗弓形虫药物的体外筛选 |
2.1 材料 |
2.1.2 实验仪器 |
2.1.3 耗材 |
2.1.4 试剂及药物 |
2.1.5 实验所用细胞和弓形虫虫株 |
2.2 方法 |
2.2.1 HFF细胞的培养 |
2.2.2 弓形虫的体外培养和传代 |
2.2.3 天然产物的细胞毒性实验 |
2.2.4 天然产物的抗弓形虫增殖效果 |
2.3 结果 |
2.3.1 天然产物对HFF细胞的毒性 |
2.3.2 天然产物对弓形虫增殖效果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 甘草查尔酮A体外抗虫效果评价 |
3.1 材料 |
3.1.2 实验仪器 |
3.1.3 耗材 |
3.1.4 试剂及药物 |
3.1.5 实验所用细胞和弓形虫虫株 |
3.2 方法 |
3.2.1 高效液相色谱法测定甘草查尔酮A在体外的药时曲线 |
3.2.2 Giemsa染色法观察甘草查尔酮A对虫体入侵的影响 |
3.2.3 评价虫体荷载量的荧光定量PCR方法的建立 |
3.2.4 Giemsa染色和荧光定量PCR测定甘草查尔酮A对虫体增殖的影响 |
3.3 结果 |
3.3.1 甘草查尔酮A在体外的药时曲线 |
3.3.2 甘草查尔酮A对虫体入侵的影响 |
3.3.3 荧光定量PCR评价虫体荷载量方法的建立 |
3.3.4 Giemsa和荧光定量PCR测定甘草查尔酮A对虫体增殖的影响 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 甘草查尔酮A对弓形虫的超微结构的影响 |
4.1 材料 |
4.1.2 实验仪器 |
4.1.3 耗材 |
4.1.4 试剂及药物 |
4.1.5 实验所用细胞和弓形虫虫株 |
4.2 方法 |
4.2.1 甘草查尔酮A对弓形虫表面超微结构的影响 |
4.2.2 透射电镜观察甘草查尔酮A对弓形虫内部超微结构的影响 |
4.2.3 尼罗红染色观察甘草查尔酮A对弓形虫脂代谢的影响 |
4.3 结果 |
4.3.1 扫描电镜观察结果 |
4.3.2 透射电镜观察结果 |
4.3.3 尼罗红染色观察结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 体内抗虫增殖效果评价 |
5.1 材料 |
5.1.2 实验仪器 |
5.1.3 耗材 |
5.1.4 试剂及药物 |
5.1.5 实验动物、细胞和弓形虫虫株 |
5.2 方法 |
5.2.1 单次给药安全剂量范围筛选 |
5.2.2 腹腔注射多次给药安全剂量确认 |
5.2.3 甘草查尔酮A对小鼠急性感染模型的治疗实验 |
5.2.4 安全性实验 |
5.3 结果 |
5.3.1 单次给药剂量范围筛选结果 |
5.3.2 腹腔注射多次给药剂量安全范围筛选结果 |
5.3.3 甘草查尔酮A对小鼠急性感染模型的治疗实验 |
5.3.4 安全性实验 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
第六章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(2)弓形虫慢性感染导致雄性小鼠生殖障碍及蛋白互作的初步研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第一章 引言 |
1.1 弓形虫慢性感染对雄性生殖系统损伤的研究进展 |
1.1.1 弓形虫慢性感染致睾丸损伤 |
1.1.2 弓形虫慢性感染致附睾损伤 |
1.2 RNA-seq测序技术 |
1.2.1 RNA测序技术平台 |
1.2.2 RNA-seq测序技术原理 |
1.2.3 RNA-seq的应用 |
1.3 研究背景和意义 |
第二章 弓形虫慢性感染对雄性小鼠生殖系统损伤的初步研究 |
2.1 材料 |
2.1.1 实验动物与虫株 |
2.1.2 引物 |
2.1.3 器械及仪器 |
2.1.4 溶液与试剂 |
2.2 方法 |
2.2.1 弓形虫PRU株慢性感染雄性小鼠模型的建立 |
2.2.2 弓形虫感染雄性小鼠对子一代小鼠的影响 |
2.2.3 弓形虫感染雄性小鼠对精子参数的影响 |
2.2.4 睾丸和附睾组织的超微结构观察 |
2.3 结果 |
2.3.1 弓形虫PRU株慢性感染雄性小鼠的症状表现 |
2.3.2 雄性感染鼠对子一代小鼠的影响 |
2.3.3 弓形虫感染对精子参数的影响 |
2.3.4 睾丸和附睾组织的超微结构观察 |
2.4 讨论 |
第三章 弓形虫感染的睾丸和附睾组织的转录组测序及分析验证 |
3.1 材料 |
3.1.1 实验动物与虫株 |
3.1.2 器械及仪器 |
3.1.3 溶液与试剂 |
3.2 方法 |
3.2.1 样品制备 |
3.2.2 RNA提取 |
3.2.3 RNA纯度分析 |
3.2.4 RNA文库构建和测序 |
3.2.5 原始数据分析和序列组装 |
3.2.6 转录物的功能注释 |
3.2.7 基因丰度评估和设置差异表达基因阈值 |
3.2.8 差异表达基因的GO和KEGGpathway富集 |
3.2.9 荧光定量PCR分析验证基因的mRNA表达水平 |
3.3 结果 |
3.3.1 RNA提取结果及质量分析 |
3.3.2 RNA测序及数据预处理 |
3.3.3 基因表达水平分析 |
3.3.4 基因差异表达分析 |
3.3.5 生物信息学分析 |
3.3.6 qPCR验证基因mRNA表达水平 |
3.4 讨论 |
3.4.1 MHC与免疫保护 |
3.4.2 糖酵解通路与精子活力 |
3.4.3 PTGDS与BTB |
第四章 PTGDS细胞定位及与弓形虫蛋白互作 |
4.1 材料 |
4.1.1 实验动物、细胞和虫株 |
4.1.2 器械及仪器 |
4.1.3 溶液与试剂 |
4.2 方法 |
4.2.1 间质细胞免疫荧光实验 |
4.2.2 免疫共沉淀联合质谱分析小鼠PTGDS与弓形虫蛋白互作 |
4.3 结果 |
4.3.1 PTGDS蛋白在间质细胞中的表达情况 |
4.3.2 免疫复合物SDS-PAGE电泳 |
4.3.3 Westernblot验证特异性结合蛋白 |
4.3.4 弓形虫蛋白注释 |
4.4 讨论 |
全文总结 |
致谢 |
参考文献 |
附录A 硕士研究生期间科研成果及获奖情况 |
附录B 与小鼠PTGDS蛋白互作的弓形虫蛋白 |
(3)苦参生物碱类成分抗弓形虫作用的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩写对照 |
第一章 绪论 |
1.1 弓形虫及弓形虫病概况 |
1.1.1 形态及生活史 |
1.1.2 传播途径 |
1.1.3 临床表现 |
1.1.4 临床诊断 |
1.2 弓形虫病的药物治疗 |
1.2.1 抗生素 |
1.2.2 化学合成药 |
1.2.3 中药制剂 |
1.2.4 生物制剂 |
1.3 苦参生物碱药理研究进展 |
1.4 本研究的目的和意义 |
第二章 弓形虫的保种及其急性动物感染模型的构建 |
2.1 材料、试剂及主要仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 弓形虫的保种 |
2.2.2 急性弓形虫小鼠感染模型的建立 |
2.3 实验结果 |
第三章 氧化苦参碱、苦参碱和槐果碱的抗弓形虫实验 |
3.1 材料、试剂及主要仪器 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 HeLa细胞的体外培养 |
3.2.2 弓形虫悬液的制备 |
3.2.3 CCK-8法测细胞增殖 |
3.2.4 光学显微镜观察 |
3.2.5 台盼蓝染色分析 |
3.2.6 体内抗弓形虫实验 |
3.2.7 肝脾指数的检测 |
3.2.8 血清中ALT和AST的测定 |
3.2.9 肝匀浆中GSH和MDA的测定 |
3.2.10 小鼠存活率分析 |
3.2.11 数据分析 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 受试化合物的细胞毒性 |
3.3.2 受试化合物抗弓形虫作用的选择性 |
3.3.3 受试化合物对细胞形态的影响 |
3.3.4 受试化合物对活细胞数目的影响 |
3.3.5 受试化合物对小鼠腹腔虫数的影响 |
3.3.6 受试化合物对小鼠肝脾重量的影响 |
3.3.7 受试化合物对血清ALT和AST的影响 |
3.3.8 受试化合物对肝脏GSH和MDA的影响 |
3.3.9 受试化合物对小鼠生存率的分析 |
第四章 讨论 |
第五章 结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间发表论文 |
(4)氟康唑抗弓形虫速殖子作用的超微结构观察(论文提纲范文)
1材料 |
1. 1虫株 |
1. 2试验动物 |
1. 3主要试剂及设备 |
1. 4药物的溶解 |
2方法 |
2. 1虫株的获取 |
2. 2试验分组及处理 |
2. 3标本固定及电镜观察 |
3结果 |
3. 1正常弓形虫速殖子超微结构 |
3. 2药物作用1 h后弓形虫速殖子的超微结构改变 |
3. 3药物作用4 h后弓形虫速殖子的超微结构改变 |
4讨论 |
(6)四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究(论文提纲范文)
目录 |
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一编 文献综述 |
第一章 弓形虫与弓形虫病 |
1 病原学 |
1.1 弓形虫在生物界的分类地位 |
1.2 弓形虫生活史中出现的不同形态 |
1.3 弓形虫的生活史 |
2 弓形虫流行病学概况 |
2.1 传染源 |
2.2 传播途径 |
2.3 弓形虫病在家禽上的流行概况 |
2.4 弓形虫病流行的新特点 |
3 弓形虫病诊断技术 |
3.1 病原学诊断方法 |
3.2 免疫学诊断方法 |
3.3 分子生物学诊断方法 |
4 弓形虫病的治疗 |
4.1 抗生素类 |
4.2 生物制剂 |
4.3 中药 |
4.4 其他药物 |
4.5 药物靶点 |
参考文献 |
第二章 宿主抗弓形虫感染的先天性免疫 |
1 宿主抗弓形虫感染的免疫分子 |
1.1 促炎性反应免疫分子与弓形虫感染 |
1.2 抗炎性反应免疫分子与弓形虫感染 |
2 宿主抗弓形虫感染的免疫细胞 |
2.1 小肠上皮细胞是抵抗弓形虫感染的第一道屏障 |
2.2 中性粒细胞在抗弓形虫感染过程中发挥着重要的作用 |
2.3 巨噬细胞在抗弓形虫感染过程中发挥着关键的作用 |
2.4 NK细胞在抗弓形虫感染过程中的作用 |
3 总结 |
参考文献 |
第三章 宿主抗弓形虫感染的获得性免疫 |
1 抗体的类型和产生的规律 |
1.1 IgM |
1.2 IgG |
1.3 IgA |
1.4 IgE |
2 B细胞抗弓形虫感染作用 |
3 T细胞抗弓形虫感染的协同作用 |
4 抗体的保护作用 |
5 抗体对弓形虫杀伤的调理作用 |
参考文献 |
第二篇 试验研究 |
第四章 江苏地区猫源弓形虫虫株的分离与鉴定 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 试剂及其配制 |
1.3 主要的仪器 |
2 方法 |
2.1 血清的采集和分离方法 |
2.2 猫血清抗体IgG的检测 |
2.3 弓形虫虫株的分离 |
2.4 瑞氏染色鉴定小鼠腹水中弓形虫 |
2.5 特异PCR鉴定 |
3 结果 |
3.1 抗体检测结果 |
3.2 猫源弓形虫分离结果 |
3.3 分离虫株的PCR鉴定 |
4 讨论 |
Abstract |
参考文献 |
第五章 猫源、鸡源和猪源弓形虫虫株基因型的鉴定 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 虫株 |
1.3 工具酶和主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 虫株的复苏与扩增 |
2.2 弓形虫基因组的提取 |
2.3 PCR扩增引物的设计与合成 |
2.4 PCR扩增反应体系及条件 |
2.5 目的DNA的酶切鉴定 |
2.6 琼脂糖凝胶电泳分析 |
3 结果 |
3.1 PCR扩增结果 |
3.2 酶切鉴定结果 |
4 讨论 |
Abstract |
参考文献 |
第六章 四种不同来源弓形虫虫株对鸡和小鼠致病力的比较 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 虫株 |
2 方法 |
2.1 虫株的扩增与计数 |
2.2 对鸡致病力对比试验 |
2.3 对小鼠致病力对比试验 |
2.4 试验动物的存活时间 |
2.5 统计分析 |
3 结果 |
3.1 对鸡致病力试验结果 |
3.2 对小鼠致病力结果 |
4 讨论 |
Abstract |
参考文献 |
第七章 四株不同动物来源弓形虫腹腔感染小鼠免疫病理变化的比较研究 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 虫株 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 虫株的扩增与计数 |
2.2 实验分组及感染 |
2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
2.4 弓形虫特异性抗体的检测 |
2.5 流式技术检测T细胞亚类、MHC分子和NK细胞 |
2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
2.8 血清铁的检测 |
2.9 统计分析 |
3 结果 |
3.1 小鼠血清中TCA检测结果 |
3.2 小鼠抗弓形虫特异性抗体的检测结果 |
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+ T和NK细胞的检测结果 |
3.4 小鼠脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
3.5 小鼠血清中细胞因子的检测结果 |
3.6 小鼠血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
3.7 小鼠血清铁的检测结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
Abstract |
第八章 四株不同动物来源弓形虫灌胃感染小鼠免疫病理变化的比较研究 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 虫株 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 虫株的扩增与计数 |
2.2 实验分组及感染 |
2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
2.4 弓形虫特异性抗体的检测 |
2.5 流式技术检测T细胞亚类、MHC分子和NK细胞 |
2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
2.8 血清铁的检测 |
2.9 统计分析 |
3 结果 |
3.1 小鼠血清中TCA检测结果 |
3.2 小鼠抗弓形虫特异性抗体的检测结果 |
3.3 小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+、CD8+T和NK细胞的检测结果 |
3.4 小鼠脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
3.5 小鼠血清中细胞因子的检测结果 |
3.6 小鼠血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
3.7 小鼠血清铁的检测结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
Abstract |
第九章 四株不同动物来源弓形虫腹腔感染鸡免疫病理变化的比较研究 |
摘要 |
1 材料 |
1.1 实验动物 |
1.2 虫株 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 虫株的扩增与计数 |
2.2 实验分组及感染 |
2.3 弓形虫循环抗原(TCA)的检测 |
2.4 弓形虫特异性抗体IgG、IgA和IgM的检测 |
2.5 流式技术检测T细胞亚类和MHC分子 |
2.6 血清细胞因子浓度的检测 |
2.7 NO浓度和NO诱生酶(iNOS)活性的检测 |
2.8 血清铁的检测 |
2.9 血细胞的检测 |
2.10 统计分析 |
3 结果 |
3.1 血清中TCA检测结果 |
3.2 血清中IgG,IgA和IgM的检测结果 |
3.3 脾脏淋巴细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的检测结果 |
3.4 脾脏淋巴细胞中MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子的检测结果 |
3.5 血清中细胞因子的检测结果 |
3.6 血清中NO和NO诱生酶(iNOS)的检测结果 |
3.7 血清铁的检测结果 |
3.8 外周血血细胞计数结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
Abstract |
全文总结 |
致谢 |
论文发表情况 |
(7)急性弓形虫小鼠感染模型的建立与抗动物弓形虫病药物的初步筛选(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 综述 |
1.1 弓形虫动物感染模型建立的影响因素 |
1.2 急性动物弓形虫感染模型的建立 |
1.3 抗弓形虫病药物的研究进展 |
1.3.1 化学合成类药物研究进展 |
1.3.2 抗生素类药物研究进展 |
1.3.3 中草药研究进展 |
1.3.4 其他药物及联合用药研究进展 |
1.4 前景和展望 |
第二章 不同保藏时间与复苏代次弓形虫对小鼠致病性的研究 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 材料 |
2.2.2 方法 |
2.3 结果 |
2.3.1 液氮冻存2 月后的弓形虫速殖子对小鼠的致病性 |
2.3.2 液氮冻存4 月后的弓形虫速殖子对小鼠的致病性 |
2.3.3 液氮冻存6 月后的弓形虫速殖子对小鼠的致病性 |
2.4 讨论 |
第三章 抗弓形虫病药物初步筛选的研究 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 实验动物 |
3.2.2 虫株 |
3.2.3 实验药物 |
3.2.4 实验设计 |
3.2.5 实验疗效评价指标 |
3.2.6 实验数据分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 药物对比治疗实验结果 |
3.3.2 新增药物对比治疗初步实验 |
3.3.3 药物不同剂量实验之低剂量比较 |
3.3.4 药物不同剂量实验之高剂量比较 |
3.4 讨论 |
第四章 磺胺类药物抗弓形虫病疗效实验研究 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验动物 |
4.2.2 虫株 |
4.2.3 药物 |
4.2.4 主要试剂 |
4.2.5 实验设计与试验方法 |
4.3 结果 |
4.3.1 磺胺类药物对比治疗实验 |
4.3.2 磺胺氯吡嗪不同给药方式疗效对比实验 |
4.3.3 巢氏PCR 检测存活小鼠内脏组织评价药物疗效 |
4.4 讨论 |
第五章 磺胺氯吡嗪对弓形虫速殖子超微结构的影响 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 实验虫株 |
5.2.2 实验动物及处理 |
5.2.3 弓形虫虫体的复苏及扩增 |
5.2.4 实验药物 |
5.2.5 主要仪器 |
5.2.6 弓形虫虫体收集、纯化及药物处理 |
5.2.7 弓形虫速殖子扫描电镜观察 |
5.2.8 弓形虫速殖子透射电镜观察 |
5.3 结果 |
5.3.1 扫描电镜观察结果 |
5.3.2 透射电镜观察结果 |
5.4 讨论 |
第六章 磺胺氯吡嗪处理弓形虫速殖子消减文库的构建 |
6.1 引言 |
6.2 材料与方法 |
6.2.1 实验虫株 |
6.2.2 实验动物及处理 |
6.2.3 弓形虫的复苏扩增 |
6.2.4 主要试剂 |
6.2.5 实验药物 |
6.2.6 主要仪器 |
6.2.7 弓形虫虫体收集、纯化及药物处理 |
6.2.8 弓形虫速殖子经不同药物处理后提取总RNA |
6.2.9 弓形虫速殖子mRNA 的分离 |
6.2.10 磺胺氯吡嗪处理的弓形虫速殖子消减文库的构建 |
6.3 结果 |
6.3.1 弓形虫速殖子总RNA 提取 |
6.3.2 Rsa I 酶切结果 |
6.3.3 消减文库重组率及所插入片段长度分析 |
6.4 讨论 |
第七章 全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(8)基于rROP18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
本论文常用英文缩写 |
第一章 文献综述 |
1 弓形虫病概述 |
1.1 弓形虫病的危害 |
1.2 弓形虫病的流行病学 |
1.3 弓形虫病的诊断方法 |
1.4 弓形虫病的防治 |
2 弓形虫抗原基因的研究进展 |
2.1 弓形虫主要表面抗原基因 |
2.2 致密颗粒抗原(GRA)基因 |
2.3 棒状蛋白(ROP)基因 |
3 抗弓形虫药物治疗研究进展 |
3.1 抗生素类 |
3.2 其他类化学药物 |
3.3 抗菌肽和毒素 |
3.4 蛋白酶抑制剂 |
3.5 中药 |
第二章 犬弓形虫病 ELISA 检测方法的初步建立 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果与分析 |
2.1 弓形虫rop18 基因PCR 扩增结果 |
2.2 重组质粒pMD18-rop18 的双酶切鉴定 |
2.3 测序结果 |
2.4 重组原核表达质粒pET32a(+)-rop18 的双酶切鉴定 |
2.5 重组质粒在大肠杆菌中的表达 |
2.6 蛋白表达形式分析 |
2.7 蛋白可溶性纯化及包涵体复性 |
2.8 Western Blot 分析融合蛋白的免疫反应性 |
2.9 基于rROP18-rSAG2 蛋白的弓形虫病间接 ELISA 诊断方法的建立 |
3 讨论 |
第三章 抗弓形虫药物的筛选及临床验证 |
1 实验一 体外抗弓形虫药物筛选试验 |
1.1 材料和方法 |
1.2 结果 |
1.3 讨论 |
2 实验二 磺胺氯丙嗪钠及其与中药复方小鼠体内抗弓形虫试验 |
2.1 材料和方法 |
2.2 结果 |
2.3 讨论 |
3 实验三 磺胺氯丙嗪钠组方对人工感染弓形虫仔猪临床疗效的试验 |
3.1 材料和方法 |
3.2 结果 |
3.3 讨论 |
第四章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
(9)抗弓形虫药物研究新进展(论文提纲范文)
1 抗生素类 |
1.1 磺胺类药 |
1.2 大环内脂类抗生素 |
1.3 半合成四环素类 |
1.4 其它类抗生素 |
2 其它类化学药物 |
2.1 氨基喹啉类 |
2.2 施田补除草剂 |
3 生物制剂 |
3.1 蛋白酶抑制剂 |
3.2 抗菌肽 (Antimicrobial peptides) |
4 中药 |
4.1 单味中药 |
4.2 主要复方中药 |
5 抗弓形虫药物研究展望 |
(10)弓形虫病分子诊断方法及弓形虫分离株耐药性的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
第一章 文献综述 |
1.1 弓形虫与弓形虫病的发现及其危害 |
1.1.1 弓形虫与弓形虫病的发现 |
1.1.2 弓形虫病的危害 |
1.1.3 猪弓形虫病与公共卫生的关系 |
1.2 弓形虫的病原学 |
1.2.1 弓形虫分类 |
1.2.2 弓形虫的各期形态结构 |
1.2.3 弓形虫生活史 |
1.2.4 流行病学 |
1.2.5 致病机制 |
1.2.6 抵抗力 |
1.3 弓形虫的主要基因与蛋白质 |
1.3.1 弓形虫表面抗原 |
1.3.2 弓形虫棒状体蛋白 |
1.3.3 弓形虫微线体蛋白 |
1.3.4 弓形虫致密颗粒蛋白 |
1.4 弓形虫病的免疫应答 |
1.4.1 先天性免疫 |
1.4.2 获得性免疫 |
1.5 弓形虫病的预防与治疗 |
1.5.1 弓形虫病的预防 |
1.5.2 弓形虫病的治疗 |
1.6 弓形虫病的诊断方法研究进展 |
1.6.1 病原学检查 |
1.6.2 免疫学检测 |
1.6.3 分子生物学诊断 |
1.6.4 目前我国弓形虫病检测试剂(盒)面临的问题 |
1.7 抗体结合蛋白研究进展 |
1.7.1 金黄色葡萄球菌蛋白A |
1.7.2 链球菌G蛋白 |
1.8 弓形虫体外培养的研究进展 |
1.8.1 弓形虫体外培养概况 |
1.8.2 弓形虫体外培养技术的应用 |
1.8.3 展望 |
第二章 MIC3在大肠杆菌中的高效表达 |
2.1 研究的目的意义 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 试验材料 |
2.2.1.1 质粒、菌株、虫株及实验动物 |
2.2.1.2 主要药品及试剂 |
2.2.1.3 主要试剂及溶液的配制 |
2.2.2 试验方法 |
2.2.2.1 兔抗弓形虫高免血清的制备 |
2.2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
2.2.2.3 连接产物及质粒的转化 |
2.2.2.4 质粒的小量制备(碱裂解法) |
2.2.2.5 诱导表达 |
2.2.2.6 最佳诱导表达条件的确定 |
2.2.2.7 不溶性表达产物(包涵体)的提取、溶解和复性 |
2.2.2.8 SDS-PAGE电泳 |
2.2.2.9 Western blot试验 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 克隆基因的选择 |
2.3.2 重组质粒在E.coli中的表达与表达产物分析鉴定 |
2.3.5 最佳诱导表达条件的确定 |
2.4 讨论 |
2.4.1 原核表达载体的选择 |
2.4.2 包涵体的提取和纯化 |
2.5 小结 |
第三章 动物弓形虫病SPA-ELISA及AG-ELISA诊断方法的建立 |
3.1 研究的目的意义 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 试验材料 |
3.2.1.1 试验动物 |
3.2.1.2 主要药品及试剂 |
3.2.1.3 血清 |
3.2.1.4 ELISA缓冲液 |
3.2.2 试验方法 |
3.2.2.1 SPA-ELISA方法的建立 |
3.2.2.2 AG-ELISA方法的建立评价 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 SPA-ELISA方法的建立 |
3.3.1.1 抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 |
3.3.1.2 封闭液浓度及封闭时间的确定 |
3.3.1.3 最适血清工作时间的确定 |
3.3.1.4 酶标SPA最适浓度和最适作用时间的确定 |
3.3.1.5 底物作用时间的确定 |
3.3.1.6 SPA-ELISA的结果判定 |
3.3.1.7 特异性试验 |
3.3.1.8 敏感性试验 |
3.3.1.9 重复性试验 |
3.3.1.10 保质期试验 |
3.3.1.11 临床动物血清样品的检测 |
3.3.2 AG-ELISA方法的建立 |
3.3.2.1 抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定 |
3.3.2.2 HRP-AG最适浓度和最适作用时间的确定 |
3.3.2.3 底物作用时间的确定 |
3.3.2.4 SPA-ELISA的结果判定 |
3.3.2.5 特异性试验 |
3.3.2.6 敏感性试验 |
3.3.2.7 重复性试验 |
3.3.2.8 保质期试验 |
3.3.2.9 临床动物血清样品的检测 |
3.3.2.10 AG-ELISA在人工感染猪血清弓形虫抗体检测中的应用 |
3.3.2.11 AG-ELISA在临床血清弓形虫抗体检测中的实际应用 |
3.4 讨论 |
3.4.1 SPA-ELISA及AG-ELISA方法的建立 |
3.4.1.1 ELISA方法的种属限制 |
3.4.1.2 AG-ELISA及SPA-ELISA判定标准的制定 |
3.4.1.3 AG-ELISA及SPA-ELIS诊断方法的评价 |
3.4.2 试验条件的优化 |
3.4.2.1 抗原对ELISA的特异性和敏感性的影响 |
3.4.2.2 抗原包被浓度的影响 |
3.4.2.3 血清对ELISA的特异性和敏感性的影响 |
3.4.2.4 封闭液的选择 |
3.4.3 ELISA操作方法的标准化 |
3.4.3.1 加样 |
3.4.3.2 温育 |
3.4.3.3 洗涤 |
3.4.3.4 比色 |
3.5 小结 |
第四章 弓形虫虫株分离及其耐药现象的初步研究 |
4.1 研究的目的与意义 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 材料 |
4.2.1.1 虫株、细胞、血清及实验动物 |
4.2.1.2 主要溶液的配制 |
4.2.2 方法 |
4.2.2.1 细胞的复苏和传代培养 |
4.2.2.2 RH株速殖子培养上清的制备 |
4.2.2.3 分离虫株所用细胞系的确定 |
4.2.2.4 细胞培养分离虫体所需条件的优化 |
4.2.2.5 野生虫株的分离 |
4.2.2.6 分离虫株的进一步鉴定 |
4.2.2.7 弓形虫磺胺耐药株的筛选及初步确定 |
4.3 结果 |
4.3.1 细胞培养条件的优化 |
4.3.2 野生虫株的分离及其鉴定 |
4.3.2.1 临床样品的预处理 |
4.3.2.2 野生虫株的分离 |
4.3.2.3 弓形虫分离株的进一步鉴定 |
4.3.3 弓形虫磺胺耐药株的筛选及初步确定 |
4.3.3.1 弓形虫分离株的体外抑制试验 |
4.3.3.2 弓形虫分离株的体内抑制试验 |
4.4 讨论 |
4.4.1 细胞培养条件的优化 |
4.4.2 样品的选择与处理 |
4.4.3 弓形虫耐药性的初步确定 |
4.5 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
致谢 |
四、扁桃酸对感染小鼠腹水中弓形虫速殖子超微结构的影响(论文参考文献)
- [1]抗弓形虫天然产物筛选与甘草查尔酮A抗虫研究[D]. 司鸿飞. 黑龙江八一农垦大学, 2018(08)
- [2]弓形虫慢性感染导致雄性小鼠生殖障碍及蛋白互作的初步研究[D]. 郑玉香. 华南农业大学, 2018(08)
- [3]苦参生物碱类成分抗弓形虫作用的研究[D]. 张晓川. 延边大学, 2016(02)
- [4]氟康唑抗弓形虫速殖子作用的超微结构观察[J]. 吴升伟,王正蓉,包怀恩. 黑龙江畜牧兽医, 2015(16)
- [5]磺胺氯吡嗪对弓形虫速殖子超微结构的影响[A]. 曾艳波,董辉,韩红玉,姜连连,赵其平,朱顺海,马卫娇,程军,黄兵. 中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集, 2012
- [6]四株不同动物来源弓形虫感染小鼠和鸡免疫病理变化的比较研究[D]. 赵光伟. 南京农业大学, 2012(12)
- [7]急性弓形虫小鼠感染模型的建立与抗动物弓形虫病药物的初步筛选[D]. 曾艳波. 中国农业科学院, 2011(10)
- [8]基于rROP18-rSAG2犬弓形虫ELISA检测技术及药物筛选研究[D]. 荆振宇. 中国农业科学院, 2011(10)
- [9]抗弓形虫药物研究新进展[J]. 朱穗京,田春林,杨雯. 热带医学杂志, 2009(06)
- [10]弓形虫病分子诊断方法及弓形虫分离株耐药性的研究[D]. 张东林. 华中农业大学, 2008(01)