一、The in vitro antiapoptotic effect of lithium chloride in mouse thymocytes（论文文献综述）
张胜男[1]（2021）在《紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究》文中指出背景:近十年来,恶性黑色素瘤的发病率一直在增加,并一度成为世界上发病率增速最快的恶性肿瘤。尽管在我国恶性黑色素瘤的发病率较低,但每年新发患者仍高达8,000～10,000例,并且以每年3%～5%的增速增长。目前恶性黑色素瘤的主要治疗方法为最大限度地手术切除,但晚期黑色素瘤多无法切除或已经转移,约10%的黑色素瘤患者被诊断为晚期只能求助靶向治疗和免疫疗法延长生存期。而在晚期黑色素瘤中,大约有30%的黑色素瘤患者在诊断时有内脏和脑部受累,对治疗产生响应的可能性非常低,其原因一方面可能由于靶向治疗和免疫疗法可能引起肿瘤细胞中某些通路的激活导致耐药性,另一方面药物毒性也使得恶性黑色素瘤患者的生存形势十分严峻。对于这一部分患者,亟需开发出多靶点且低毒的新型药物,改善生存质量延长生存期。紫杉叶素（TAX）作为一种天然黄酮类化合物,属维生素P族,是一种效果显着的抗氧化剂,具有多种生物活性。研究发现,紫杉叶素可引起癌细胞凋亡,诱发癌细胞周期阻滞,促进癌细胞分化,但紫杉叶素在黑色素瘤中的疗效及其起效机制尚不清楚。恶性黑色素瘤存在MAPK通路异常激活的现象,有研究表明紫杉叶素可通过抑制MAPK通路发挥抗炎活性,猜测紫杉叶素可能通过抑制MAPK通路发挥抗肿瘤作用。目的:在本研究中,以恶性程度最高的小鼠B16F10黑色素瘤细胞为模型,通过体内外实验观察紫杉叶素对黑色素瘤的治疗效果,探讨紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制。方法:实验分为对照组和TAX组（低剂量200μM/高剂量400μM）。（1）用CCK8分别测定小鼠黑色素瘤高转移细胞B16F10和大鼠心肌细胞H9C2的细胞活力。细胞计数法测定细胞生长速率,克隆形成实验、Ed U染色检测细胞增殖情况。细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Western blot检测迁移相关蛋白的表达。（2）采用RNA-seq筛查差异基因,利用R软件和KEGG数据库富集差异基因至肿瘤相关通路,并选取其中最显着通路进行后续实验。（3）Western blot检测MAPK通路关键蛋白ERKs、JNKs、P38、Rac1、c-Myc表达水平,以判断TAX对该通路的影响。进一步分析Rac1/JNK轴下游β-Catenin入核情况及MITF的表达,并进一步与JNK抑制剂SP600125和JNK激活剂茴香霉素对β-Catenin核定位的现象进行比较。（4）利用ERK激活剂表皮生长因子,β-Catenin激活剂氯化锂,JNK激活剂茴香霉素分别与紫杉叶素合用的方式,通过细胞免疫荧光实验进一步分析紫杉叶素影响β-Catenin核定位的起效机制。接着通过CCK8法分析紫杉叶素抑制B16F10细胞增殖的起效机制。（5）进一步分析RNA-seq差异基因集,筛选出差异最显着且差异倍数最大的基因,利用Western blot进一步验证RNA-seq结果,根据该基因的功能推测其对MAPK通路的影响,利用Co-IP实验检测JNK的泛素化水平。构建USP18过表达质粒,回复性验证紫杉叶素对Rac1和JNK的表达情况。（6）紫杉叶素对荷瘤小鼠的治疗作用:C57/BL6小鼠皮下注射3×106个B16F10细胞,构建皮下荷瘤小鼠模型。按照30mg/kg或60mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射,每日一次,一共进行11天;对小鼠肿瘤组织的质量进行统计分析;对小鼠肿瘤组织及其各脏器组织切片进行HE染色,对小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学染色检测肿瘤组织细胞形态及增殖标志物的表达,通过Western blot检测MAPK/β-Catenin通路蛋白表达情况,采用免疫荧光染色法观察β-Catenin的核定位情况。结果:紫杉叶素可显着抑制黑色素瘤细胞B16F10的活力和增殖能力,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）,在相同剂量下,紫杉叶素对大鼠心肌细胞H9C2的活力无明显影响,差异不具有统计学意义（P>0.05）。通过RNA-seq对差异基因进行富集,发现差异最显着的通路为MAPK通路,对该通路关键分子ERKs、JNKs、P38、Rac1的表达进行检测,发现TAX具有抑制MAPK通路的作用。结果显示增殖相关MITF、c-Myc均下调。分离细胞核后Western Blot检测到β-Catenin入核受到抑制,其现象与SP600125导致的入核减少相似。JNK促进剂茴香霉素可逆转TAX诱导的JNK蛋白下调现象。免疫荧光实验结果显示,ERK激活剂表皮生长因子并不能够逆转紫杉叶素抑制β-Catenin入核的现象,但β-Catenin激活剂氯化锂、JNK促进剂剂茴香霉素均能逆转该现象。CCK8实验显示表皮生长因子、氯化锂、茴香霉素均能翻转TAX抑制B16F10细胞活力的表型,确定TAX分别抑制ERK/c-Myc途径和JNK/β-catenin途径抑制增殖和迁移。通过进一步分析RNA-seq差异基因获取差异显着基因USP18,通过Western Blot对其表达进行验证。结合其功能对JNK的泛素化水平进行了验证,发现紫杉叶素使JNK的泛素化水平增加,促进其降解。构建USP18过表达质粒瞬时转染后加药处理,发现与单加药组JNK和Rac1的下调明显受到明显抑制,蛋白稳定性明显提高,提示TAX通过抑制USP18抑制Rac1及JNK的表达。体内实验发现紫杉叶素对荷瘤小鼠的黑色素瘤的体积和质量及骨转移有显着抑制作用,但对小鼠体重及脏器无明显影响,并抑制PCNA、Ki67的表达,此现象通过抑制MAPK/β-Catenin介导。结论:（1）紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制B16F10细胞增殖和迁移。（2）紫杉叶素通过抑制USP18调控Rac1/JNK/β-catenin轴。（3）紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制小鼠体内黑色素移植瘤生长和转移。
薛均来[2]（2021）在《丹参酮ⅡA抑制Nrf2/ARE信号通路促进结肠癌细胞凋亡的机制研究》文中提出研究背景:结肠癌是常见的消化道恶性疾病,多发于直肠与乙状结肠交界处,发病率高居消化道恶性肿瘤第三位,由于不良生活习惯等原因,其发生率仍在不断增加。目前结肠癌的主要治疗手段是手术,尽管现在可以根据患者的情况提供各种综合治疗以及个性化治疗,比如化学药物治疗和免疫治疗等,然而化疗常伴随不良反应并且容易产生耐药,同时免疫治疗成本过高。因此,开发和寻找新型的抗肿瘤药物对于提高结肠癌患者的生存质量及生存期极为重要。丹参酮ⅡA（Tanshinone IIA,Tan IIA）是唇形科植物丹参中的主要脂溶性组合物之一,是丹参中最丰富的二萜醌类,是单酰基甘油脂肪酶的天然抑制剂。丹参酮ⅡA具有多种药理作用,包括抗炎、抗癌和抗动脉粥样硬化活性,以及心血管保护。目前,丹参酮ⅡA的抗肿瘤活性已在多种癌症中得到验证,如:诱导细胞周期阻滞、凋亡、自噬和抑制细胞迁移。有研究表明,丹参酮ⅡA能够抑制结肠癌的发生发展,但是相关研究仍没有具体阐明丹参酮ⅡA的具体作用机制。因此,本研究以丹参酮ⅡA为研究对象,探究对结肠癌发展的抑制作用及其具体作用机制。研究内容包括:1)评估丹参酮ⅡA对结肠癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响,确定丹参酮ⅡA的作用,以及丹参酮ⅡA影响的细胞状态等相关指标。2)通过蛋白质组学分析,筛选受丹参酮ⅡA影响的蛋白表达变化,并通过生物信息学分析相关信号通路。3)通过对相关信号通路的抑制、回补等实验策略,研究丹参酮ⅡA具体作用的信号通路,以阐明丹参酮ⅡA具体作用机制,为丹参酮ⅡA的临床应用提供实验基础。研究方法:1、通过CCK-8实验检测丹参酮ⅡA对结肠癌细胞作用的浓度依赖性和时间依赖性。2、通过CCK-8、细胞计数、克隆形成和裸鼠移植瘤实验,研究丹参酮ⅡA对结肠癌细胞增殖能力的影响。3、通过细胞划痕和Transwell实验,研究丹参酮ⅡA对结肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。4、通过流式细胞术检测丹参酮ⅡA对结肠癌细胞存活能力、细胞凋亡的影响。5、通过试剂盒检测细胞中GSH、NADPH和ATP的水平探究丹参酮ⅡA对于细胞内氧化还原稳态和ROS水平的影响。6、通过蛋白组学技术探究丹参酮ⅡA处理结肠癌细胞引起的蛋白质组的改变,通过生物信息学分析,筛选丹参酮ⅡA显着影响的细胞信号通路。7、通过Western blot、real-time PCR、荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀实验检测丹参酮ⅡA对于Nrf2/ARE信号通路的影响。8、通过核浆分离实验检测丹参酮ⅡA对于Nrf2亚细胞定位的影响。9、通过Nrf2回补实验,结合流式细胞术及RT-PCR实验检测Nrf2对丹参酮ⅡA对结肠癌细胞抑制作用的影响。实验结果:1、丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞增殖和肿瘤生长。通过用不同浓度丹参酮ⅡA处理结肠癌细胞系HCT-116及LoVo不同时间,发现丹参酮ⅡA对结肠癌细胞的增殖呈现时间和剂量的依赖性。CCK-8、克隆形成和细胞增殖曲线结果表明,丹参酮ⅡA明显抑制结肠癌细胞的增殖。动物移植瘤实验结果表明,丹参酮ⅡA显着抑制移植瘤生长。2、丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞侵袭和迁移。通过细胞划痕和Transwell迁移和侵袭实验,结果显示丹参酮ⅡA显着抑制划痕的愈合,并且降低穿过Transwell小室的细胞数量。3、丹参酮ⅡA提高结肠癌细胞中ROS水平并引起凋亡。通过流式细胞仪检测,发现丹参酮ⅡA明显促进结肠癌细胞凋亡的发生。进一步分析发现,丹参酮ⅡA可以提高细胞内的ROS水平,同时降低细胞内GSH、NAPDH、ATP等水平,并且抗氧化剂处理可以抑制丹参酮ⅡA引起的细胞死亡和ROS提高。因此,丹参酮ⅡA参与了细胞内氧化稳态的调控。4、丹参酮ⅡA处理影响细胞中Nrf2/ARE信号通路。将对照组及丹参酮ⅡA处理组细胞进行蛋白组学检测,通过对122个差异蛋白进行生物信息学分析,结果提示丹参酮ⅡA可能影响Nrf2/ARE信号通路,尤其是其下游经典抗氧化基因的表达,如NQO1、HO1、GCLC等。5、丹参酮ⅡA通过抑制Nrf2/ARE信号通路引起细胞死亡。通过RT-PCR以及Westernblot检测,明确了丹参酮ⅡA对Nrf2下游基因表达的抑制作用。报告基因和染色质免疫共沉淀实验表明,丹参酮ⅡA抑制了Nrf2的转录活性。由于Nrf2发挥其功能需要定位于细胞核中,核浆分离确定了丹参酮ⅡA影响了Nrf2的细胞核定位。进一步研究发现细胞核表达的Nrf2,可以抑制丹参酮ⅡA引起的细胞死亡和ROS提高,同时能够抑制丹参酮ⅡA引起的抗氧化基因表达下调。实验结论:本研究以丹参酮ⅡA和结肠癌为主要研究对象,以肿瘤的发生发展机制作为指导,借鉴国内外研究的最新相关成果,综合运用细胞增殖实验、凋亡实验、转移侵袭实验、裸鼠移植瘤实验、流式细胞术、蛋白质组学分析等为研究手段,深入研究丹参酮ⅡA在抑制结肠癌进展中的分子作用机制。研究结果表明丹参酮ⅡA作为一种传统中药提取物具有抗癌作用,通过提高细胞中的ROS水平进而诱导细胞凋亡,抑制结肠癌细胞的转移侵袭能力。丹参酮ⅡA通过抑制Nrf2/ARE信号通路从而抑制抗氧化基因的表达,进而打破细胞内氧化稳态导致细胞凋亡的机制。因此,这一机制的阐明为丹参酮ⅡA针对结肠癌的治疗提供了理论依据和实验基础,具有重要意义。
徐凤凤[3]（2021）在《iNOS、Arg-1在癫痫共病抑郁大鼠额前皮质、海马和杏仁核中的表达比较》文中提出研究背景癫痫与抑郁症在神经生物学方面互相影响,二者联系复杂密切。额前皮质、海马及杏仁核是与癫痫及抑郁症的发病均密切相关的重要脑区。目前的研究已经发现小胶质细胞参与了癫痫及抑郁症的发病;M1型小胶质细胞具有促炎作用,M2型小胶质细胞具有抗炎作用;癫痫发作或慢性抑郁刺激可诱导M1型小胶质细胞表型标记物i NOS表达增多,M2型小胶质细胞表型标记物Arg-1表达减少。但目前尚无有关i NOS及Arg-1在癫痫共病抑郁中的系统研究报道。本实验旨在通过免疫组织化学染色法及TUNEL原位末端标记法检测癫痫共病抑郁大鼠额前皮质、海马及杏仁核区i NOS、Arg-1的表达及神经元凋亡情况,比较癫痫共病抑郁大鼠情感障碍相关脑区i NOS、Arg-1蛋白的表达差异及神经元凋亡情况,为深入探讨小胶质细胞在癫痫共病抑郁中的作用提供前期基础。研究目的检测癫痫共病抑郁大鼠模型额前皮质、海马及杏仁核中i NOS及Arg-1蛋白的表达及神经细胞凋亡情况,以了解情感障碍相关脑区小胶质细胞不同活化类型在癫痫共病抑郁发病中的作用。研究方法采用氯化锂-匹罗卡品法建立癫痫大鼠模型,于造模后第14天对模型大鼠进行抑郁行为学评分,根据评分结果筛选抑郁大鼠,伴发抑郁者为癫痫共病抑郁组（共病组）;无抑郁者为癫痫组。并采用慢性不可预见中等应激刺激（Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS）结合孤养法建立抑郁大鼠模型（抑郁组）;同时设立正常对照组;每组5只大鼠。各组大鼠每周进行一次抑郁行为学评分,并于CUMS第4周末进行免疫组化及TUNEL原位末端标记检测各组大鼠额前皮质、海马及杏仁核i NOS、Arg-1蛋白的表达情况及神经元细胞凋亡情况。结果行为学各项指标结果:造模后4周,与正常组和癫痫组比较,癫痫共病抑郁组大鼠的体重指数、蔗糖偏好率、水平运动、垂直运动得分均明显减少,差异有统计学意义（均P<0.05）。与抑郁组相比,癫痫共病抑郁组大鼠蔗糖偏好率及水平运动均明显降低,差异有统计学意义（均P<0.05）。免疫组织化学染色检测结果显示:癫痫共病抑郁组与各对照组相比,癫痫共病抑郁组大鼠额前皮质、海马、杏仁核i NOS免疫组化平均光密度值明显增多（均P<0.05）;Arg-1平均光密度值均明显减少（均P<0.05）。癫痫共病抑郁组各脑区i NOS、Arg-1的比较:大鼠海马i NOS的平均光密度值较额前皮质及杏仁核明显增多（P<0.05）;海马及额前皮质区Arg-1平均光密度值较杏仁核明显升高（P<0.05）,Arg-1在海马和额前皮质中差异无统计学意义（P>0.05）。TUNEL染色检测结果显示:癫痫共病抑郁组与各对照组相比:癫痫共病抑郁组大鼠额前皮质、海马、杏仁核TUNEL阳性细胞数明显增多（均P<0.05）。癫痫共病抑郁组各脑区TUNEL阳性细胞量的比较:大鼠海马TUNEL阳性细胞数量较额前皮质、杏仁核明显增多（均P<0.05）。结论氯化锂-匹罗卡品可成功诱导癫痫共病抑郁模型;癫痫共病抑郁大鼠情感障碍脑区额前皮质、海马、杏仁核中M1型（促炎型）小胶质细胞活化增多,M2型（抗炎型）小胶质细胞活化减少,凋亡神经细胞增多;癫痫共病抑郁大鼠海马M1型（促炎型）小胶质细胞活化及凋亡神经细胞较额前皮质及杏仁核明显增多,可能在癫痫共病抑郁发病中发挥了更大的作用。
齐印宝[4]（2021）在《miR-494靶向作用于RIPK1调控NF-κB信号通路在癫痫海马神经元损伤中的作用及机制》文中研究说明目的本研究拟阐明微小RNA-494（microRNA-494,miR-494）、受体相互作用蛋白激酶1（Receptor interacting protein-1,RIPK1）表达水平与癫痫海马神经元损伤的关系,并证明miR-494通过靶向下调RIPK1的表达,抑制NF-κ B信号通路的活性,促进神经元细胞增殖、抑制细胞凋亡,延缓癫痫（Epilepsy,Ep）进展,进而对癫痫海马神经元损伤发挥保护作用的机制。方法1.收集颞叶癫痫患者的脑组织颞叶海马区标本,定量PCR检测miR-494、RIPK1 mRNA的表达水平;分析miR-494表达水平与RIPK1的关系,分析miR-494表达水平与患者病程、首次发作年龄、病因、是否合并其他疾病等的关系。2.建立氯化锂-毛果芸香碱癫痫大鼠模型,结合miR-494 agomir、RIPK1 siRNA和miR-494 agomir+oe-RIPK 1处理大鼠,观察大鼠的行为学和电脑图改变,HE染色、电镜检查、尼氏染色、FJC染色观察海马神经元细胞损伤,Hoechst 33342染色、Tunnel染色观察海马神经元凋亡,定量PCR和Western Blot检测海马神经元NF-κB信号通路活化情况。3.体外分离新生SD大鼠原代神经元细胞,用无镁细胞外液诱导建立EP样神将元模型。双荧光素酶报告基因证明miR-494和RIPK1的相互作用;分别用miR-494 agomir、RIPK1 siRNA和miR-94 agomir+oe-RIPK1处理EP样神将元细胞,MTT检测细胞增殖、Hoechst 33342染色和流式检测细胞凋亡,定量PCR和Western Blot检测NF-κB信号通路活化,通过体外研究观察miR-494、RIPK1的表达水平对Ep样神经元细胞增殖、凋亡和细胞中NF-κB信号通路活化的影响。结果1.癫痫患者颞叶脑组织中的miR-494表达水平是对照组的（0.71±0.22）倍（p<0.05）;RIPK1表达水平是对照组的（1.89±0.28）（p<0.05）。其颞叶脑组织中miR-494和RIPK1 mRNA水平之间存在负相关性,r=0.6578,p<0.001。2.病程≤5年组、5-10年（含）组和>10年组患者脑组织miR-494 mRNA相对表达量为（0.82±0.19）、（0.61±0.15）和（0.43±0.11）,病程长的患者miR-494水平低于病程短的患者（p<0.05）。3.首次癫痫发作年龄<18岁的患者miR-494相对表达水平为（0.65±0.10）,首次癫痫发作年龄≥18岁的患者miR-494相对表达水平为（0.82±0.12）,首发年龄小的患者miR-494水平低于首发年龄大的患者（p<0.05）。4.利用氯化锂-毛果芸香碱诱导大鼠癫痫建模成功率为95%。Ep组大鼠脑电图的棘慢波数量较正常对照组明显增加（p<0.05）;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组的棘慢波数量较agomir-NC组和siRNA-NC组明显减少（p均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的棘慢波数目与 agomir-miR-494 组相比明显增加（P<0.05）。5.HE染色显示,正常组大鼠神经元细胞排列整齐、结构完整、形态正常;Ep组、agomir NC组和siRNA-NC组神经元细胞呈三角形,胞质浓缩,出现核分裂和隐性核仁;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组海马神经元损伤程度较Ep组有所减轻;agomir-miR-494+oe-RIPK1组的损伤程度较agomir-miR-494组加重。6.电镜显示,正常组大鼠的神经元染色质分布均匀,细胞核呈卵圆形,核仁清晰,超微结构正常。Ep组、agomir NC组和siRNA-NC组的大鼠神经元有大量异染色质,无粗面内质网和游离核糖体。Agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组大鼠神经元超微结构正常,有粗面内质网、核糖体和线粒体。Agomir-miR-494+oe-RIPK1组海马神经元损伤较agomir-miR-494组加重。7.尼氏染色结果显示,Ep组的神经元数量较正常组减少（p<0.05）。Agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组神经元数量较 agomir-NC 组和 siRNA-NC 组增多（p均<0.05）;agomirniR-494+oe-RIPK1组的神经元数量较agomir-miR-494 组减少（p<0.05）。8.FJC染色显示,Ep组的FJC 阳性的变性神经元细胞较正常组增多（p<0.05）;agomir-miR-494组和RIPK1-siRNA组FJC阳性细胞数目较agomir NC组和siRNA-NC 组减少（p 均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 FJC 阳性细胞较 agomir-miR-494 组增加（p 均<0.05）。9.TUNEL染色结果显示,Ep组凋亡神经元较正常组增加（p<0.05）。agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组的阳性细胞较 agomir NC 组和 siRNA-NC 组减少（p 均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的阳性细胞较agomir-miR-494 组增加（p 均<0.05）。10.Hoechst 33258染色结果显示,Ep组细胞凋亡率较正常组升高（p<0.05）;Agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA1 组的凋亡率较 agomir-NC 组和 siRNA-NC 组下降（p 均<0.05）;Agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的凋亡率较 agomir-miR-494组升高（p均<0.05）。11.定量PCR和Western blot结果表明,与正常组相比,Ep组Bc1-2的mRNA和蛋白表达明显降低,而Bax的mRNA和蛋白表达却明显升高（p均<0.05）;agomir-miR-494 组和 RIPK1-siRNA 组的 Bc1-2 的 mRNA 和蛋白表达较 agomir-NC组和siRNA-NC组升高,而Bax的mRNA和蛋白表达降低（p均<0.05）;agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 Bc1-2 的 mRNA 和蛋白表达较 agomir-miR-494组下降,而Bax的mRNA和蛋白表达升高（p均<0.05）。12.定量PCR和Western Blot结果显示,与正常组相比,Ep组大鼠海马区miR-494 表达明显下降（p<0.01）,RIPK1 和 NF-κ Bp65 的表达增加（p<0.01）;agomir-miR-494 组的 miR-494 表达较 agomir-NC 组升高（p<0.01）,RIPK1 和 NF-κ Bp65 表达降低（p<0.01）。RIPK1-siRNA 组海马组织 RIPK1 和 NF-κ Bp65 的表达较 siRNA-NC 组降低（p<0.01）。agomir-miR-494+oe-RIPK1 组的 RIPK1 和 NF-κ Bp65 表达较 agomir-miR-494 组升高（p<0.05）。13.体外分离培养的大鼠海马神经元细胞在培养第1天即发生粘附;第3天时细胞体积开始变大;第7天细胞胞体变长,并且数目增加。神经元纯度鉴定结果表明,体外分离的海马神经元细胞纯度超过90%。14.MTT分析显示,Ep组神经元细胞生存能力较对照组下降（p<0.05）。miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组细胞存活力较mimic NC组和siRNA-NC组增强（p 均<0.05）,miR-494mimic+oe-RIPK1 组的细胞活力较 miR-494 mimic 组降低（p均<0.05）。15.Hoechst 33342染色显示,对照组细胞核呈圆形或椭圆形均匀染色,形态规则;Ep组、模拟NC组和siRNA-NC组神经元细胞均出现了角化变性、凋亡荧光信号增强、核碎裂和凋亡小体（p均<0.05）。MiR-494mimic组和RIPK1-siRNA组细胞凋亡较Ep组减少;miR-494 mimic+oe-RIPK1组凋亡细胞较miR-494 mimic组增加（p均<0.05）。16.Annexin V-FITC/PI双染结果表明,Ep组神经元的细胞凋亡率明显增加;miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组神经元的凋亡率明显低于mimic NC组和 siRNA-NC 组（p 均<0.05）;miR-494 mimic 组+oe-RIPK1 组神经元细胞的凋亡率明显高于miR-494 mimic组（p均<0.05）。17.定量PCR和Western blot结果表明,Ep组神经元细胞中Bcl-2表达水平明显降低,而Bax表达水平较对照组升高（p均<0.05）。miR-494 mimic组和RIPK1-siRNA组的神经元细胞中Bcl-2表达较mimic NC组和siRNA-NC组增加,Bax 表达却明显降低（p 均<0.05）。Bcl-2 表达在 miR-494 mimic 组+oe-RIPK1组明显低于miR-494 mimic组,Bax表达增升高（p均<0.05）。18.双荧光素酶报告基因检测显示,wt-miR-494报告基因载体和oe-RIPK1共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性降低较wt-miR-494报告基因载体和mimic NC组降低（p<0.05）,而mut-miR-494报告基因载体和oe-RIPK1共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性较mut-miR-494报告基因载体和oe-NC共转染的海马神经元细胞中荧光素酶活性无显着差异（p>0.05）。19.定量PCR和Western blot结果表明,Ep组miR-494表达较对照组降低,而RIPK1和NF-κ Bp65的表达则明显高于对照组（p<0.05）;miR-494 mimic组miR-494的表达水平明显高于mimic NC组,而RIPK1和NF-κ Bp65的表达明显降低（p<0.05）;RIPK1-siRNA 组的 RIPK1 和 NF-κ B p65 表达明显低于 siRNA-NC组（p<0.05）;miR-494 mimic+oe-RIPK1 组的 RIPK1 和 NF-κ B p65 表达较miR-494 mimic 组增加（p<0.05）。结论1.癫痫患者脑组织中miR-494表达降低,RIPK1表达升高,miR-494水平与患者的病程和首次发作时年龄有关,提示miR-494是一个癫痫有关的因子2.miR-494能抑制RIPK1表达,进而引起NF-κ B信号通路的失活,导致Ep大鼠海马神经元细胞增殖能力上升,细胞凋亡被抑制,从而减轻神经元损伤和Ep进展。
彭莉蓉[5]（2021）在《LPS通过影响lncRNA MIR155HG的m6A修饰调控肝癌的免疫逃逸及其机制研究》文中提出一、研究背景中国的肝癌发病率居世界最高国家之列,无论是发病例数还是死亡例数均占全球的一半以上。由于我国肝癌患者大多发现迟、分期晚,确诊时约仅20%患者可手术切除,而对于大多数患者来说,现有治疗手段非常有限。尽管索拉非尼一直是晚期、不可切除肝癌的治疗金标准,但其对患者生存时间的改善却很有限。免疫治疗在这种情况下应运而生,为肝癌患者带来了曙光。然而免疫治疗低的反应率以及昂贵的治疗费用使得大部分患者望而却步。为了提高免疫治疗疗效,深入了解肝癌免疫微环境并揭示其形成免疫逃逸的机制迫在眉睫。肠道菌被报道参与了包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展,尤其是肝脏特殊的解剖结构决定了其与肠道菌关系更为紧密。深入探讨肠道产物对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）免疫微环境的影响有利于揭开HCC复杂免疫微环境的面纱。有研究证明脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可以通过toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）结合适配器蛋白髓样分化标志物88（adaptor protein myeloid differentiation marker 88,My D88）刺激靶细胞,对免疫应答产生重要影响,既可介导抗肿瘤免疫,也可促进免疫逃逸。但LPS在HCC免疫微环境调控中发挥的作用尚不明了。因此,探讨LPS对HCC免疫微环境的影响及其分子机制可为改善HCC的免疫治疗疗效提供新的方向。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lnc RNAs）是一类长度大于200个核苷酸的非编码蛋白转录本,可参与调控生命发育的各个阶段以及生理病理进程。近年来,不断有研究发现lnc RNA可以通过多种方式参与免疫调控过程,包括肿瘤的免疫抵抗以及免疫逃逸。lnc RNA MIR155HG,又称为B细胞整合集群（B-cell integration cluster,BIC）,被认为在肿瘤发展和免疫调控中发挥着重要功能。但是MIR155HG在肝癌中的作用尚未见报道。因此本研究重点探索了MIR155HG在LPS介导的肝癌免疫逃逸中的作用及其机制。二、研究方法利用GEPIA（The gene expression profiling interactive analysis）和TIMER（Tumor immune estimation resource）在线分析工具分析TCGA（The cancer genome atlas）数据库中MIR155HG在各类肿瘤中的表达以及与预后的关系,并分析MIR155HG的表达与免疫细胞、免疫分子之间的相关性。q RT-PCR检测胆管癌和肝细胞癌临床组织标本中MIR155HG与免疫检查点分子细胞程序性死亡-配体1（programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4）之间的关系。收集未接受术前治疗的肝癌患者血浆样本,利用鲎试剂检测并比较肝癌与肝硬化肝癌患者血浆中LPS的水平。在小鼠体内检测LPS对肝癌组织免疫检查点分子程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1,PD-1）和PD-L1的表达的影响。检测LPS刺激对肝癌细胞PD-L1表达的影响,并利用T细胞介导的肿瘤杀伤实验分析活化的T细胞对LPS刺激过的HCC细胞的杀伤作用。随后利用GEPIA2在线工具分析LPS激活的主要分子TLR4和My D88与MIR155HG以及PD-L1之间的相关性关系,寻找LPS调控PD-L1表达机制。在肝癌细胞中研究LPS对MIR155HG以及MIR155HG对PD-L1的调控作用。分析METTL14在LPS诱导MIR155HG表达中的作用,并利用RNA pull down、RIP（RNA binding protein immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀）、双荧光素酶报告实验等手段研究其机制。Lnc Locator数据库预测并用FISH（fluorescence in situ hybridization,荧光原位杂交）实验验证MIR155HG在肝癌细胞中的亚细胞定位。Star Base 3.0预测与MIR155HG结合的mi RNA以及与该mi RNA结合的靶m RNA,双荧光素酶报告实验检测MIR155HG与mi RNA,mi RNA与靶基因的相互作用。小鼠体内验证MIR155HG对PD-L1的调控作用。并在细胞及小鼠体内研究MIR155HG对HCC生长的影响。最后,在TCGA数据库和临床组织标本以及小鼠体内验证LPS-METTL14-MIR155HG-PD-L1调控轴。三、研究结果1.在多种类型肿瘤中,MIR155HG在肿瘤组织和正常组织中表达有差异,并且与肿瘤的分期及预后有关,MIR155HG在胆管癌、多形性胶质细胞瘤、皮肤黑色素瘤等肿瘤中可以作为预后的指标。2.在包括肝癌在内的绝大多数类型的肿瘤中,MIR155HG与免疫细胞的浸润、免疫分子的表达、尤其是免疫检查点分子PD-1、PD-L1、CTLA4等的表达关系密切。3.TCGA肝癌数据分析发现LPS激活的通路分子TLR4和My D88与MIR155HG和PD-L1之间呈正相关关系。临床HCC患者标本结果显示,肝硬化肝癌患者血浆LPS水平和肿瘤组织PD-L1表达较不伴随肝硬化的肝癌患者高。4.在小鼠体内,腹腔注射LPS上调了肝癌组织PD-1和PD-L1的表达,促进了肿瘤的生长,并且肝癌细胞中敲低MIR155HG抑制PD-L1的表达。5.LPS刺激和过表达MIR155HG均使得肝癌细胞PD-L1的表达上调,并且上调的PD-L1具有抑制T细胞介导的杀伤功能。Rescue实验发现MIR155HG在LPS诱导的PD-L1过程中发挥关键的调控作用。6.LPS通过上调RNA甲基转移酶METTL14促进MIR155HG发生N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰,通过m6A-ELAVL1依赖的方式稳定MIR155HG。7.细胞实验结果显示MIR155HG通过ce RNA机制竞争性抑制mi R-223-3p与STAT1 3’UTR的结合从而上调PD-L1的表达。小鼠体内实验证实MIR155HG通过mi R-223-3p/STAT1通路调控PD-L1的表达。8.MIR155HG对肝癌细胞生长以及迁移无显着影响。9.肝癌患者肿瘤组织中PD-L1的表达与LPS通路激活以及METTL14-MIR155HG-PD-L1信号有关。10.肝硬化肝癌患者肿瘤组织METTL14-MIR155HG-STAT1轴上调。四、结论本研究揭示LPS通过影响MIR155HG的m6A修饰上调PD-L1的表达从而引起HCC免疫逃逸,并且肝硬化肝癌患者免疫逃逸微环境的形成可能与高水平的LPS密切有关。当前的研究结果不仅为LPS诱导HCC分子机制提供了新的视角,并且推动了HCC有效的免疫治疗策略的发展。
乔羽君[6]（2021）在《丹参酮ⅡA改善癫痫所致海马神经元损伤及相关作用机制的研究》文中研究指明目的:本课题以无镁外液诱导原代培养海马神经元癫痫模型和氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型为研究对象,选取中药单体成分丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA,TSⅡA）为治疗药物,分别从细胞水平和动物水平考察TSⅡA对癫痫模型痫性放电、癫痫所致海马神经元损伤及MAPK/ERK/CREB信号通路相关蛋白表达量的影响,探讨TSⅡA在癫痫治疗中的作用及其机制,为开发潜在的癫痫治疗药物提供理论依据。方法:（1）细胞水平分离Wistar乳鼠（新生24 h内）海马神经元,原代培养后鉴定其纯度。将实验分为空白组（Control）、模型组（Model）、丙戊酸钠组（VPA,10μM）和丹参酮ⅡA低剂量组（TSⅡA-L,3μM）、丹参酮ⅡA中剂量组（TSⅡA-M,10μM）和丹参酮ⅡA高剂量组（TSⅡA-H,20μM）。构建体外无镁外液诱导海马神经元癫痫样放电模型。细胞旁灌流给药相应药物后,采用膜片钳技术检测各组海马神经元癫痫样自发放电频率和动作电位的变化;加入不同浓度的TSⅡA培养海马神经元24h,利用Sholl软件分析各组海马神经元突起的复杂程度和总长度;采用Western blot方法测定各组海马神经元p-ERK/ERK、p-CREB/CREB、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表达情况。（2）动物水平建立氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫模型。实验分为空白组（Control）、模型组（Model）、丙戊酸钠组（VPA,200 mg/kg）和丹参酮ⅡA低剂量组（TSⅡA-L,10mg/kg）、丹参酮ⅡA中剂量组（TSⅡA-M,20 mg/kg）和丹参酮ⅡA高剂量组（TSⅡA-H,30 mg/kg）。观察并记录各组大鼠行为学（评价指标包括癫痫发作次数、平均持续时间和发作级别）;应用脑电记录仪监测各组大鼠脑电波图的变化;采用尼氏染色、Neun染色和Hochest染色分别观察各组大鼠海马组织CA1和CA3区病理结构变化和神经元的凋亡情况;利用免疫印迹技术测定各组大鼠海马组织p-ERK/ERK、p-CREB/CREB、Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白的表达情况。结果:（1）成功分离、培养并鉴定原代培养海马神经元。膜片钳实验结果显示,TSⅡA能够明显降低无镁外液诱导的海马神经元癫痫模型自发放电频率（P<0.01）,影响动作电位的发放。Sholl软件分析结果表明,TSⅡA可以增加无镁外液诱导海马神经元癫痫模型突起的复杂程度和总长度。（2）成功建立氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠癫痫模型。大鼠行为学和脑电图结果显示,与Model组相比,TSⅡA-M组和TSⅡA-H组大鼠发作次数、平均持续时间减少、发作级别明显降低（P<0.05,0.01）,癫痫样波减少,放电频率和波幅显着降低;组织病理学结果表明,与Model组相比,TSⅡA各给药组癫痫大鼠CA1和CA3区神经元损伤逐渐缓解,排列逐渐整齐,核固缩碎裂等病理形态明显改善,尼氏体数量和Neun阳性表达量增加,神经元凋亡率明显降低（P<0.05,0.01）。（3）采用Western blot方法测定体内大鼠癫痫模型和体外原代培养海马神经元癫痫模型中MAPK/ERK/CREB信号通路相关蛋白的表达量。结果显示,与Model组相比,TSⅡA各剂量组p-ERK/ERK、p-CREB/CREB及凋亡因子Caspase-3、Bax表达量降低,Bcl-2表达量明显增加。结论:（1）TSⅡA可以减少无镁外液诱导的原代海马神经元癫痫模型自发放电频率,抑制神经元癫痫样放电;改善海马神经元癫痫模型突起损伤,增加神经元轴突和树突总长度。（2）TSⅡA能够缓解氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫大鼠的痫性发作,有效减弱癫痫大鼠的痫性放电;改善癫痫大鼠海马CA1和CA3区神经元的损伤和丢失,降低癫痫大鼠海马神经元的凋亡率,发挥一定的神经保护作用。（3）TSⅡA能够降低海马p-ERK/ERK、p-CREB/CREB及凋亡相关因子Caspase-3、Bax的表达量,增加Bcl-2的表达量,提示TSⅡA缓解癫痫发作,改善癫痫所致海马神经元损伤的作用可能与调控MAPK/ERK/CREB信号转导通路有关。
王秋霏,顾叶,彭育沁,薛峰,巨荣,朱锋,王熠军,耿德春,徐耀增[7]（2021）在《人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响》文中指出背景:随着人工关节置换后中远期随访研究的推进发现,置换后中远期出现假体周围松动是限制人工假体使用年限、制约人工关节置换发展的重要因素。目的:通过梳理磨损颗粒诱导下Wnt/β-catenin信号通路主要信号因子对成骨细胞及成骨细胞来源细胞功能方面的研究成果,以进一步深入理解Wnt/β-catenin信号通路,并为药物治疗等提供新的靶点。方法:由第一作者应用计算机检索2005至2020年出版的文献,中文以"磨损颗粒,假体周围骨溶解,假体无菌性松动,发病机制,成骨细胞,信号通路,骨重建,Wnt/β-catenin"检索知网、万方、维普数据库;英文以"wear debris,wear particles,peri-prosthetic osteolysis,PPO,Aseptic loosening,AL,Pathogenesis,osteoblast,OB,Signal path,bone remodeling,Wnt/β-catenin"检索Pub Med和Web of Science数据库,收录与磨损颗粒影响下Wnt/β-catenin通路主要对成骨细胞的影响及作用机制相关的文献报道,按照入选标准共纳入53篇文章。结果与结论:①磨损颗粒诱导假体周围骨溶解、无菌性松动的病理过程中,Wnt/β-catenin信号通路激活后通过抑制成骨形成、增加破骨吸收进而影响骨重建,在磨损颗粒诱导假体周围骨溶解、无菌性松动的病理过程中起到了关键性的作用;②在体外实验中,通过应用GSK-3β抑制剂Li Cl、生长激素释放多肽以及蛋白磷酸酶2A抑制可以激活Wnt/β-catenin等信号通路,促进成骨细胞分化及成骨活动;而ICG-001抑制剂阻断了β-catenin信号通路从而减弱了Li Cl对成骨细胞分化的保护作用,提示GSK-3β/β-catenin信号通路可能是介导钛磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的重要机制;③在体内实验中,通过应用骨硬化蛋白抗体、蛋白磷酸酶2A抑制、Li Cl、AR28等方式通过激活Wnt/β-catenin等信号通路后,进而促进成骨形成,抑制破骨吸收,增加局部骨量及骨体积,对抗钛等磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解作用;④基因层面,在骨硬化蛋白静默条件下,即使用钛粒子处理下MC3T3-E1细胞的活性以及矿化也明显增强;相反,减少骨硬化蛋白的表达水平反而增加了β-catenin的表达水平;结果提示基因表达的降低可激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨形成,改善钛颗粒引起的骨丢失。
吴琼[8]（2021）在《TLR4/NF-κB炎症通路调控CX3CR1介导小胶质细胞过度突触修剪在大鼠癫痫后脑损伤中的作用研究》文中指出目的:发育期癫痫是婴幼儿常见的急危重症,其中部分为难治性癫痫或癫痫持续状态。癫痫能导致发育期不同程度脑损伤,严重者可危及生命,近年来治疗儿童癫痫后脑损伤,改善其认知功能已成为儿科医生们迫切需要解决的关键问题。目前尚无行之有效的治疗手段,而过度的突触修剪是这一症状中重要致病原因,但具体机制不清楚。我们前期实验研究发现癫痫动物模型中突触修剪的关键蛋白CX3CR1表达增加,同时出现炎性因子表达增多。因此,我们提出“小胶质细胞（MG）介导TLR4/NF-κB的信号通路,使IL-1β增多,促进CX3CR1表达增加,加重突触修剪作用,进而促进癫痫后脑损伤”的假说。本项目首先揭示小胶质细胞在癫痫后出现小胶质细胞激活和极化,并发现在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4、NF-κB与Iba-1蛋白呈现正相关性增高,同时小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1表达增多可能参与过度突触修剪,导致癫痫的发生和加重,从而加重癫痫后脑损伤;其次在细胞水平上通过下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和抑制小胶质细胞的CX3CR1表达,而产生抗癫痫作用。最后在体内进一步验证,通过下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和极化,抑制小胶质细胞的CX3CR1高表达,促进突触蛋白表达,抑制突触数量减少,改善突触超微结构,从而抑制过度突触修剪,抑制癫痫的发生和加重,从而改善癫痫后脑损伤,本研究以重要的科学问题—癫痫后脑损伤的突触修剪作用与机制为切入点,通过分子生物学、细胞培养等方法研究小胶质细胞分泌炎性因子,上调CX3CR1促进突触修剪在癫痫后脑损伤中的作用及机制深入研究,为癫痫脑损伤的发病机制提供新思路。研究方法:本研究分为体内动物实验和体外细胞实验两部分。1、第一部分体内动物实验部分:本研究采用生后21天幼年Sprague-Dawley（SD）大鼠,雄性,体重45g～60g,每组12只,随机分组为正常对照组和匹鲁卡品诱导癫痫持续状态SD大鼠组,并选取6个不同时间点（4h、12h、1d、2d、3d、7d）,每个时间点12只,采用腹腔注射匹鲁卡品建立癫痫持续状态模型并观察行为学,记录脑电图改变,HE染色和TUNEL染色分别观察海马CA1、CA3、DG区神经元损伤情况,通过免疫组化和Western blot检测癫痫持续状态后海马区小胶质细胞的激活和极化情况,并通过RT-PCR检测M1和M2型相关因子表达,通过荧光双标,检测海马区小胶质细胞表达TLR4,NF-κB,CX3CR1的表达变化,及与小胶质细胞Iba-1表达的相关性。2、第二部分体外细胞实验部分:本研究采用生后1～3天新生Sprague-Dawley（SD）大鼠,雄性,分离并传代原代小胶质细胞后,细胞分为4组进行试验。I组正常对照组（Ctrl组）;II组无镁溶液处理的大鼠小胶质细胞单层(Mg2+free组):取原代小胶质细胞培养至第3天的小胶质细胞,进行无镁细胞液处理3h;III组:无镁溶液处理大鼠小胶质细胞单层加入TLR4siRNA组(Mg2+free+TLR4siRNA组):取原代小胶质细胞培养至第3天的大鼠小胶质细胞,体外培养液中加入TLR4-siRNA（100pmol/ml）,培养48h后,加入无镁细胞液处理继续培养3h。IV组:无镁溶液处理大鼠小胶质细胞单层加入NF-κB阻断剂组(Mg2+free+BAY 11-7082组):取原代小胶质细胞培养至第3天的小胶质细胞,加入5μM NF-κB阻断剂（BAY11-7082）处理6h,加入无镁细胞液处理继续培养3h。RT-PCR检测各组小胶质细胞的M1型相关分子表达情况,RT-PCR和Westen blot检测下调TLR4/NF-κB炎症通路无镁溶液处理后各组小胶质细胞中CX3CR1的表达变化,Westen blot检测下调TLR4/NF-κB炎症通路无镁溶液处理后小胶质细胞中TLR4、NF-κB、IκB的表达变化。3、第二部分体内动物实验部分:本研究选取生后21天幼年雄性SD大鼠（体重45g～60g）,每组22只,随机分组,分为I正常对照组;II匹鲁卡品诱导癫痫持续状态SD大鼠组;III溶剂处理SD大鼠腹腔注射NF-κB抑制剂（BAY 11-7082）组;IV溶剂处理SD大鼠腹腔注射TLR4抑制剂（TAK-242）组;干预组分别于造模后1h,1d,2d每天1次腹腔注射NF-κB阻断剂组BAY11-7082和TLR4抑制剂（TAK-242）,造模成功后干预后2d取材,TUNEL和Nissl染色检测各组海马区脑损伤情况,荧光染色和Westen blot检测观察各组海马区小胶质细胞和相关M1,M2因子表达情况,双重免疫荧光染色,Westen blot检测、PCR检测TLR4、NF-κB、CX3CR1的表达,Westen blot检测突触前后蛋白的表达情况,电镜观察突触超微结构,造模成功7天后每组10只,通过Morris水迷宫进行认知功能检测和旷场检测一般运动能力、智力和焦虑相关的情绪行为。所有数据采用SPSS19.0软件进行数据处理和Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析,对于实验中的计量资料结果以均数±标准差来表示（mean±SD）,如两组数据进行比较则采用t检验分析结果,如多个样本数据进行比较,则用均数比较采用单因素方差方法分析结果。其中P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果:1、Iba-1蛋白的在Ctrl组表达最少,癫痫持续状态后分别与Ctrl组比较4h略有升高,12h逐渐增多（P<0.05）,1d（P<0.001）,2d达峰值（P<0.001）,3d略有下降（P<0.01）,1w接近Ctrl组。癫痫组幼年大鼠在12h、1d、2d、3d后小胶质细胞中CD86,CD14,CD206和Arg-1的m RNA含量随着时间逐渐升高,其中1d、2d、3d与其相应的正常对照组比较,均有显着差异,在第2天表达达峰值。2、Tunel染色发现在SE后2d海马各区Tunel阳性细胞达峰。3、本研究发现在小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1在癫痫持续状态后不同程度增高,本研究发现癫痫持续状态后有不同程度突触前蛋白表达减少。4、在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4/NF-κB与Iba-1蛋白表达呈正相关性。5、在细胞水平上无镁溶液处理后大鼠小胶质细胞中炎症因子IL-1β（P<0.001）和TNF-α表达增加（P<0.01）,BAY11-7082处理后炎症因子IL-1β（P<0.01）和TNF-α表达降低（P<0.01）和siRNA-TLR4处理后炎症因子IL-1β（P<0.001）和TNF-α表达降低（P<0.01）;与正常大鼠小胶质细胞比较,无镁溶液处理大鼠小胶质细胞中CX3CR1蛋白水平表达量明显增加（P<0.01）,BAY11-7082处理后CX3CR1蛋白水平表达量明显减少（P<0.05）和siRNA-TLR4处理后CX3CR1蛋白水平表达量明显减少（P<0.01）;与正常大鼠小胶质细胞比较,无镁溶液处理大鼠小胶质细胞中TLR4和NF-κB的蛋白水平明显增加（P<0.01）,而IκB表达降低（P<0.01）,NF-κB抑制剂BAY11-7082处理后与无镁溶液处理组比较TLR4（P<0.05）和NF-κB的蛋白水平减少（P<0.01）,而IκB表达增加（P<0.05）。而siRNA-TLR4处理后与无镁溶液处理组比较TLR4（P<0.01）和NF-κB的蛋白水平减少（P<0.05）,而IκB表达增加（P<0.01）。6、癫痫发作频率:与EP组相比EP+BAY组大鼠2d内抽搐次数减少（P<0.001）,与EP组相比EP+TAK组大鼠2d内抽搐次数减少（P<0.001）;癫痫发作分级:与EP组相比EP+BAY组大鼠2d内抽搐发作强度降低（P<0.01）,与EP组相比EP+TAK组大鼠2d内抽搐发作强度降低（P<0.001）;死亡率:EP组2d内死亡率约为5.5%,而EP+BAY组和EP+TAK组2d内无死亡。7、通过TUNEL和Nissl染色观察各组神经元损伤情况,观察TUNEL阳性细胞数计数和尼氏小体细胞计数Epilepsy组表达最明显,分别与Ctrl组、EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异;Neu N在Epilepsy组表达最少,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001。8、TLR4、NF-κB及CX3CR1分别在Epilepsy组表达最多,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001;9、SYP及PSD95在Epilepsy组表达最少,分别与Ctrl组,EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异P<0.001。电镜下观察癫痫组突触数量减少,突触超微结构模糊,突触后膜变薄、扭曲甚至中断,密度减低,突触间隙较Ctrl组变得狭窄并且不规则,给予干预后突触结构趋向于正常组,各组海马区突触数目统计Epilepsy组突触数目较Ctrl组少,Epilepsy组分别与Ctrl组、EP+BAY组和EP+TAK组比较有统计学差异。10、Morris水迷宫试验中第1～4天逃避潜伏期各组无统计学差异,EP组在第5天逃避潜伏期较Ctrl组延长P<0.05,EP+BAY 11-7082较EP组逃避潜伏期缩短P<0.05,EP+TAK-242较EP组逃避潜伏期缩短P<0.001;EP组较Ctrl组穿越平台次数减少P<0.001,EP+BAY11-7082较EP组穿越平台次数增多P<0.05,EP+TAK-242较EP组穿越平台次数增多P<0.01。EP组较Ctrl组目标象限运动时间缩短P<0.001,EP+BAY 11-7082较EP组目标象限运动时间增多P<0.05,EP+TAK-242较EP组目标象限运动时间增多P<0.01。11、旷场实验中EP组较Ctrl组中央区停留时间延迟P<0.001,中央区运动距离延长P<0.001,总距离延长P<0.001,平均速度增快P<0.001,EP+BAY 11-7082较EP组中央区停留时间缩短P<0.01,中央区运动距离缩短P<0.01,总距离缩短P<0.001,平均速度减慢P<0.001,EP+TAK-242较较EP组中央区停留时间缩短P<0.01,中央区运动距离缩短P<0.01,总距离缩短P<0.001,平均速度减慢P<0.001,EP+BAY 11-7082和EP+TAK-242治疗后不同程度好转。结论:1、在组织水平上证明了小胶质细胞在癫痫后出现小胶质细胞激活和极化,在癫痫持续状态后2天达到峰值,其中M1型和M2型因子表达不同程度增多,在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4、NF-κB与Iba-1蛋白呈现正相关性增高,同时小胶质细胞表达的趋化因子受体CX3CR1表达也呈现正相关性增多,突触前蛋白表达减少,由此可推测TLR4/NF-κB信号通路可能参与小胶质细胞在癫痫中的激活和极化,可能参与过度突触修剪,导致癫痫的发生和加重,从而加重癫痫后脑损伤。2、在细胞水平上证明了无镁溶液处理后的小胶质细胞通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制其激活和CX3CR1表达降低而产生抗癫痫作用。3、在组织水平上证明了通过癫痫中下调TLR4/NF-κB炎症通路抑制小胶质细胞激活和极化,抑制M1型和M2型细胞因子表达;同时抑制趋化因子受体CX3CR1表达,促进突触前膜蛋白和后膜蛋白表达,增加突触数量,改善突触超微结构使其规整,减少过度突触修剪导致的突触E/I失衡,抑制癫痫的发生和加重,从而改善癫痫后脑损伤。通过水迷宫实验和旷场实验证实下调TLR4/NF-κB炎症通路后可改善幼年大鼠癫痫后脑损伤提高认知和情绪行为能力。
武作龙[9]（2021）在《SKI通过Wnt/β-catenin信号通路介导IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和细胞外基质代谢》文中认为目的:检测SKI在不同程度椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）髓核组织中的表达及意义,并进一步研究SKI与髓核细胞凋亡和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢的关系。方法:基于MRI的Pfirrmann分级系统,收集不同分级IDD的髓核组织样本,采用反转录酶-聚合酶链锁反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）、Western blot技术以及免疫组织化学染色法（immunohistochemistry,IHC）比较不同分级IDD髓核组织中SKI的m RNA和蛋白表达情况。采用酶消化法获得人的原代髓核细胞。使用白介素1-β（Interleukin 1β,IL-1β）刺激髓核细胞模拟IDD的细胞模型。使用慢病毒包被的si RNA下调髓核细胞中SKI的表达,氯化锂（lithium chloride,Li Cl）激活Wnt/β-catenin信号通路。综合运用Western blot、免疫荧光、TUNEL染色法检测细胞凋亡、ECM代谢以及Wnt/β-catenin信号通路中的相关蛋白表达变化。结果:通过IHC分析发现,相比于早期退变（Grade II）髓核组织,晚期退变Grade IV)髓核组织中SKI的阳性表达率更高。RT-PCR和Western blot实验发现,SKI的表达与IDD分级呈正相关。在体外,IL-1β诱导的髓核细胞退变模型中,细胞凋亡率明显增加,凋亡相关蛋白和ECM降解酶也显着增加,而抗凋亡相关分子和ECM相关蛋白却明显减少,另外,SKI的表达也出现显着的升高,并且在24h时达到峰值。当用慢病毒包被的si RNA敲减SKI后,发现IL-1β介导的髓核细胞凋亡和ECM降解明显好转。用Li Cl处理后,反转了SKI敲减对IL-1β介导的髓核细胞凋亡和ECM降解的保护作用。结论:本研究证实,SKI的表达与IDD程度呈现正相关。在IL-1β诱导的髓核细胞退变模型中,SKI下调通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减少了髓核细胞的凋亡和ECM的代谢。因此,SKI可能是治疗IDD的有效靶点。
朱恒宇[10]（2020）在《可见/近红外吸收有机染料用于上转换光诱导释放和生物正交标记》文中研究指明随着生物化学领域科技的不断发展,如何更好的治疗癌症成为科研工作者们所关心的问题。光既可作为触发诱导手段释放药物等活性物质,用于治疗等方面的应用,也可以作为治疗方式,其中光动力治疗方案自被提出以来,由于其相比于传统的肿瘤治疗手段具有显着的优势,例如通过分子结构的设计,能够将光敏材料靶向肿瘤组织,或者通过光照时长来控制治疗的进度等,故而受到人们广泛的关注。但是光动力疗法对氧气的依赖度极高,而肿瘤内部乏氧的环境会大大限制其治疗的效果,同时大多数肿瘤都生存在生物体内部,所以光疗时对于光源的穿透深度有较高的要求。因此如何利用肿瘤内部的乏氧环境,在进行光动力治疗的同时也能够提升治疗效果成为亟需解决的问题。而如何在不影响生物体正常生理功能的条件下,敏化材料能够准确靶向目标,同时可以被近红外光源激发,也是肿瘤治疗过程中所需要解决的问题。对于以上问题开展的主要研究内容如下:（1）对于传统光动力治疗过程中的乏氧问题,大多数分子改良方案都是设计携带氧气或能够内部释放氧气的基团,从而提高治疗效果。但是这无法从根本上解决乏氧的问题,我们通过设计并合成Ru（bpy）3和DNCP衍生物（DNCP-F,DNCP-Me,DNCP-Me O）组合成分子组,利用三线态-三线态湮灭（TTA）上转换释放过程,将具有光触发诱导释放功能性分子的化合物与光敏剂相结合,实现在有氧条件下可以进行光动力治疗,而在氧气耗尽后能够通过三线态-三线态湮灭（TTA）上转换释放一氧化碳分子进行治疗。通过紫外-可见吸收光谱和核磁共振波谱的测试分析,我们证实在体外通过上转换释放过程能够实现治疗小分子的激活释放。进一步的,我们对几组分子组分别进行反应动力学计算,并对其进行分析总结。（2）大多数传统光敏剂的激发波长较短,导致在光动力治疗过程中激发光源的穿透深度受限,从而进一步的影响治疗效果。我们通过设计合成了四嗪-花菁（Tz-Cy7）化合物,在测试分析过程中证实这是一种近红外染料,并且在文献中已被证实具有光疗的特性,近红外的激发光源会大大提高其组织穿透深度。此外,四嗪-花菁中的四嗪单元可以与降冰片烯发生生物正交反应,这便为靶向治疗提供了设计可能,通过提前将降冰片烯单元固定于特殊位置,再引入四嗪-花菁化合物,由于生物正交反应的高选择性,高反应活性和高产率等特性,能够实现更加精确的光疗或生物成像等应用。
二、The in vitro antiapoptotic effect of lithium chloride in mouse thymocytes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The in vitro antiapoptotic effect of lithium chloride in mouse thymocytes（论文提纲范文）
（1）紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 恶性黑色素瘤 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 晚期黑色素瘤的治疗方法 |
| 1.1.3 恶性黑色素瘤的发生 |
| 1.1.4 MAPK通路在黑色素瘤中异常激活 |
| 1.1.5 Wnt/β-Catenin通路激活在黑色素瘤中与转移和免疫逃逸有关 |
| 1.2 紫杉叶素 |
| 1.2.1 紫杉叶素的毒性 |
| 1.2.2 紫杉叶素抗氧化作用 |
| 1.2.3 紫杉叶素的抗炎作用 |
| 1.2.4 紫杉叶素的抗纤维化反应 |
| 1.2.5 紫杉叶素的抗糖化作用 |
| 1.3 紫杉叶素与肿瘤 |
| 1.3.1 紫杉叶素诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 1.3.2 紫杉叶素引起肿瘤细胞周期阻滞 |
| 1.3.3 紫杉叶素诱导细胞分化 |
| 1.3.4 紫杉叶素减轻多药耐药性 |
| 1.4 紫杉叶素治疗肿瘤过程中可能的起效机制 |
| 1.4.1 Nrf2 抗氧化应激通路 |
| 1.4.2 MAPK通路 |
| 1.4.3 Wnt/β-Catenin通路 |
| 1.4.4 TGF-β/Smad通路 |
| 1.4.5 NF-κB通路 |
| 1.4.6 TNF-α和IL-6 |
| 1.4.7 JAK2/Stat3和Notch通路 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 紫杉叶素工作液配制 |
| 2.2.3 CCK8 细胞活力检测 |
| 2.2.4 细胞生长计数 |
| 2.2.5 EdU细胞增殖检测 |
| 2.2.6 细胞克隆形成实验 |
| 2.2.7 细胞划痕实验 |
| 2.2.8 RNA-seq转录组测序 |
| 2.2.9 KEGG分析 |
| 2.2.10 Western blot检测 |
| 2.2.11 细胞爬片免疫荧光染色 |
| 2.2.12 细胞瞬时转染 |
| 2.2.13 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 2.2.14 组织HE染色 |
| 2.2.15 免疫组织化学染色 |
| 2.2.16 组织免疫荧光实验 |
| 2.2.17 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 紫杉叶素对B16增殖和迁移的影响 |
| 3.1.1 紫杉叶素对B16F10和H9C2细胞活力的影响 |
| 3.1.2 紫杉叶素抑制了B16F10细胞的增殖 |
| 3.1.3 紫杉叶素抑制B16F10细胞迁移 |
| 3.2 紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路抑制B16F10细胞增殖和迁移 |
| 3.2.1 RNA-seq测序筛查紫杉叶素调控的信号通路 |
| 3.2.2 转录组测序技术KEGG富集分析 |
| 3.2.3 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子ERK表达的影响 |
| 3.2.4 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子p38表达的影响 |
| 3.2.5 紫杉叶素对MAPK信号通路关键分子JNK、Rac1表达的影响 |
| 3.2.6 紫杉叶素抑制Rac1/JNK轴影响β-catenin核定位 |
| 3.2.7 紫杉叶素通过抑制JNK而非ERK抑制β-Catenin入核 |
| 3.2.8 紫杉叶素通过MAPK/β-Catenin通路影响细胞活力 |
| 3.3 紫杉叶素通过抑制USP18调控Rac1/JNK/β-catenin轴 |
| 3.3.1 紫杉叶素在MAPK通路中可能的上游关键靶点 |
| 3.3.2 紫杉叶素对USP18表达的影响以及JNK泛素化的影响 |
| 3.3.3 紫杉叶素通过抑制USP18的表达调控Rac1/JNK/β-catenin轴 |
| 3.4 紫杉叶素对小鼠B16F10移植瘤的影响 |
| 3.4.1 紫杉叶素对小鼠体重以及肿瘤体积的影响 |
| 3.4.2 HE染色观察紫杉叶素对小鼠脏器的影响 |
| 3.4.3 紫杉叶素对荷瘤小鼠黑色素瘤组织ERK及其下游蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 紫杉叶素对荷瘤小鼠黑色素瘤组织Rac1/JNK/β-Catenin相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 免疫荧光染色观察紫杉叶素对β-Catenin入核的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 项目资助 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）丹参酮ⅡA抑制Nrf2/ARE信号通路促进结肠癌细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 结肠癌 |
| 2.1.1 结肠癌流行病学 |
| 2.1.2 结肠癌的发病机制 |
| 2.1.3 结肠癌的治疗方案 |
| 2.2 丹参酮ⅡA |
| 2.2.1 中药的应用现状 |
| 2.2.2 丹参酮ⅡA的机制研究 |
| 2.2.3 丹参酮ⅡA的应用 |
| 2.3 细胞凋亡与活性氧 |
| 2.3.1 细胞凋亡 |
| 2.3.2 活性氧 |
| 2.3.3 ROS与细胞凋亡的关系 |
| 2.4 Nrf2/ARE信号通路 |
| 2.5 定量蛋白质组学简介 |
| 2.5.1 蛋白质组学概述 |
| 2.5.2 免标记定量(Label-free quantification) |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要抗体 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要引物 |
| 3.1.5 细胞系 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 CCK8 细胞活性检测 |
| 3.2.3 克隆形成 |
| 3.2.4 细胞生长曲线 |
| 3.2.5 蛋白提取与Western blot |
| 3.2.6 RNA提取与RT-PCR |
| 3.2.7 侵袭转移 |
| 3.2.8 ROS检测 |
| 3.2.9 ATP水平检测 |
| 3.2.10 GSH检测 |
| 3.2.11 质谱分析样品前处理 |
| 3.2.12 肽段除盐 |
| 3.2.13 纳升液相色谱-质谱联用分析 |
| 3.2.14 蛋白定性和非标记定量分析 |
| 3.2.15 生物信息学分析 |
| 3.2.16 NADPH检测 |
| 3.2.17 免疫荧光 |
| 3.2.18 小鼠移植瘤实验 |
| 3.2.19 免疫组织化学染色 |
| 3.2.20 核蛋白提取 |
| 3.2.21 染色质免疫共沉淀 |
| 3.2.22 分子克隆实验 |
| 3.2.23 统计分析 |
| 第4章 实验结果 |
| 4.1 丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞增殖和肿瘤生长 |
| 4.1.1 丹参酮ⅡA浓度依赖性抑制结肠癌细胞增殖 |
| 4.1.2 丹参酮ⅡA时间依赖性抑制结肠癌细胞增殖 |
| 4.1.3 丹参酮ⅡA抑制肠癌细胞生长 |
| 4.1.4 丹参酮ⅡA抑制异种移植小鼠肿瘤生长 |
| 4.2 丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞迁移和侵袭 |
| 4.2.1 丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞迁移 |
| 4.2.2 丹参酮ⅡA抑制结肠癌细胞侵袭 |
| 4.3 丹参酮ⅡA对结肠癌细胞作用机制的探究 |
| 4.3.1 丹参酮ⅡA促进HCT-116和LoVo细胞死亡 |
| 4.3.2 丹参酮ⅡA引起HCT-116和LoVo细胞凋亡 |
| 4.3.3 丹参酮ⅡA引起肿瘤中Capase3 激活 |
| 4.3.4 丹参酮ⅡA引起细胞ROS水平升高 |
| 4.3.5 丹参酮ⅡA降低HCT-116和LoVo细胞内GSH水平 |
| 4.3.6 丹参酮ⅡA降低HCT-116和LoVo细胞内NADPH水平 |
| 4.3.7 丹参酮ⅡA降低HCT-116和LoVo细胞的ATP水平 |
| 4.3.8 NAC和 GSH抑制丹参酮ⅡA引起的细胞死亡 |
| 4.4 蛋白组学筛选丹参酮ⅡA调控的信号通路 |
| 4.4.1 丹参酮ⅡA处理结肠癌细胞蛋白质组学筛选 |
| 4.4.2 丹参酮ⅡA处理结肠癌细胞差异蛋白分析 |
| 4.5 丹参酮ⅡA抑制Nrf2/ARE信号通路 |
| 4.5.1 丹参酮ⅡA抑制Nrf2信号通路靶基因的表达 |
| 4.5.2 丹参酮ⅡA抑制Nrf2的转录活性 |
| 4.5.3 丹参酮ⅡA抑制Nrf2细胞核定位 |
| 4.5.4 丹参酮ⅡA通过抑制Nrf2提高ROS促进细胞凋亡 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介与科研成果 |
| 致谢 |
（3）iNOS、Arg-1在癫痫共病抑郁大鼠额前皮质、海马和杏仁核中的表达比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料和实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 相关仪器 |
| 2.1.4 相关溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 癫痫模型的制备 |
| 2.2.3 抑郁模型的建立 |
| 2.2.4 行为学测试方法 |
| 2.2.5 标本处理和检测指标 |
| 2.2.6 图像分析 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫共病抑郁模型 |
| 3.2 行为学测试结果 |
| 3.3 小胶质细胞标记物i NOS、Arg-1 的表达情况 |
| 3.3.1 各组大鼠额前皮质iNOS、Arg-1 蛋白的表达变化 |
| 3.3.2 各组大鼠海马iNOS、Arg-1 蛋白的表达变化 |
| 3.3.3 各组大鼠杏仁核iNOS、Arg-1 蛋白的表达变化 |
| 3.4 各组大鼠额前皮质、海马、杏仁核TUNEL阳性细胞的表达变化 |
| 3.4.1 癫痫共病抑郁大鼠不同脑区iNOS、Arg-1 的表达及TUNEL阳性细胞量变化 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 癫痫共病抑郁模型 |
| 4.2 小胶质细胞与癫痫共病抑郁 |
| 4.2.1 小胶质细胞 |
| 4.2.2 小胶质细胞和癫痫 |
| 4.2.3 小胶质细胞与抑郁症 |
| 4.2.4 小胶质细胞标记物iNOS及 Arg-1 与癫痫及抑郁 |
| 4.3 细胞凋亡在癫痫共病抑郁发病中的作用 |
| 4.4 不同脑区与癫痫共病抑郁 |
| 4.4.1 额前皮质与癫痫及抑郁症 |
| 4.4.2 杏仁核与癫痫及抑郁症 |
| 4.4.3 海马与癫痫及抑郁症 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 不足之处及展望 |
| 第七章 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 癫痫共病抑郁发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）miR-494靶向作用于RIPK1调控NF-κB信号通路在癫痫海马神经元损伤中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词/符号说明 |
| 第1部分 研究背景 |
| 第2部分 miR-494/RIPK1在癫痫患者脑组织中的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3部分 miR-494/RIPK1对SD大鼠癫痫模型海马神经元损伤的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4部分 miR-494/RIPK1调控NF-κB信号通路参与癫痫海马神经元损伤的机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 miR-494、RIPK1、NF-kB信号通路与瘰痫研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（5）LPS通过影响lncRNA MIR155HG的m6A修饰调控肝癌的免疫逃逸及其机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA MIR155HG在包括肝癌在内的多种类型肿瘤中与免疫的关系 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 LPS通过MIR155HG调控肝癌细胞PD-L1 的表达及其临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 LPS通过调控MIR155HG的 m6A修饰影响肝癌细胞PD-L1 表达的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码 RNA 在免疫调控中的作用 |
| 参考文献 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（6）丹参酮ⅡA改善癫痫所致海马神经元损伤及相关作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 癫痫 |
| 1.1.1 癫痫概述 |
| 1.1.2 癫痫治疗与神经元保护机制 |
| 1.2 MAPK/ERK/CREB信号通路 |
| 1.2.1 MAPK/ERK/CREB概述 |
| 1.2.2 MAPK/ERK/CREB在神经系统疾病中的调控作用 |
| 1.3 丹参酮IIA与癫痫治疗 |
| 1.3.1 丹参酮IIA发挥神经保护作用 |
| 1.3.2 丹参酮IIA治疗癫痫现状 |
| 第二章 丹参酮IIA对无镁外液诱导原代培养海马神经元癫痫样放电的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 药品与试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 体外大鼠海马神经元的原代培养 |
| 2.2.2 体外培养原代海马神经元的纯度鉴定 |
| 2.2.3 膜片钳电生理记录 |
| 2.2.4 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原代培养大鼠海马神经元形态学观察结果 |
| 2.3.2 原代培养大鼠海马神经元的鉴定 |
| 2.3.3 海马神经元无镁细胞外液处理前后动作电位的变化 |
| 2.3.4 丹参酮IIA对原代培养海马神经元无镁诱发癫痫的抑制作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 丹参酮IIA对无镁诱导海马神经元癫痫模型突起复杂性的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原代海马神经元的培养与鉴定 |
| 3.2.2 大鼠海马神经元癫痫模型的建立 |
| 3.2.3 实验分组 |
| 3.2.4 免疫荧光染色 |
| 3.2.5 海马神经元轴突和树突形态学的观察 |
| 3.2.6 海马神经元突起复杂程度的分析 |
| 3.2.7 海马神经元树突和轴突总长度的测量 |
| 3.2.8 数据处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 各组海马神经元生长状态及突起复杂程度分析结果 |
| 3.3.2 各组海马神经元突起总长度的测量结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 丹参酮IIA在无镁诱导海马神经元癫痫模型中调控MAPK/ERK/CREB信号通路的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品与试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 提取蛋白样品 |
| 4.2.2 凝胶电泳(SDS-PAGE聚丙烯酰胺) |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 各组原代培养海马神经元中P-ERK、ERK、p-CREB和 CREB蛋白的表达情况 |
| 4.3.2 各组原代培养海马神经元中Caspase-3、Bax和 Bcl-2 蛋白的表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 丹参酮IIA对氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫大鼠行为学及脑电波图的影响 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂与溶液配制 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 大鼠癫痫模型的建立、分组及给药 |
| 5.2.2 大鼠癫痫发作行为学记录 |
| 5.2.3 脑电波图检测及记录 |
| 5.2.4 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 造模情况和筛选 |
| 5.3.2 丹参酮IIA对致痫大鼠痫性发作行为学的影响 |
| 5.3.3 丹参酮IIA对致痫大鼠脑电图的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 丹参酮IIA对癫痫大鼠海马神经元保护作用的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 癫痫模型的建立 |
| 6.2.2 实验分组及给药 |
| 6.2.3 尼氏染色 |
| 6.2.4 Neun染色 |
| 6.2.5 Hochest染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 尼氏染色结果 |
| 6.3.2 Neun染色结果 |
| 6.3.3 Hochest染色结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 丹参酮IIA对氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫大鼠海马MAPK/ERK/CREB信号通路的影响 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 实验动物 |
| 7.1.2 药品与试剂 |
| 7.1.3 实验仪器 |
| 7.1.4 试剂配制 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 造模及分组 |
| 7.2.2 蛋白样品的制备 |
| 7.2.3 凝胶电泳(SDS-PAGE聚丙烯酰胺) |
| 7.2.4 数据分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 各组大鼠海马组织中P-ERK、ERK、p-CREB和 CREB蛋白的表达情况 |
| 7.3.2 各组大鼠海马组织中Caspase-3、Bax和 Bcl-2 蛋白的表达情况 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 资料和方法Data and methods |
| 1.1 资料来源 |
| 1.2 入选标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 质量评估 |
| 2 结果Results |
| 2.1 关节置换术后无菌性松动与假体周围骨溶解 |
| 2.1.1假体周围骨溶解 |
| 2.1.2 磨损颗粒影响下成骨细胞与假体周围骨溶解 |
| 2.1.3 信号通路在成骨细胞诱导假体周围骨溶解过程中的作用 |
| 2.2 Wnt/β-catenin信号通路及其重要信号分子 |
| 2.2.1 Wnt/β-catenin信号通路的分子学机制 |
| 2.2.2 GSK-3β在信号通路中的作用及对成骨细胞的影响 |
| 2.2.3 β-catenin在信号通路中的作用及对成骨细胞的影响 |
| 2.2.4 Wnt/β-catenin信号通路其他信号因子对成骨细胞的影响 |
| 2.3 磨损颗粒诱导下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响 |
| 3 不足及展望Shortcomings and prospects |
（8）TLR4/NF-κB炎症通路调控CX3CR1介导小胶质细胞过度突触修剪在大鼠癫痫后脑损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:癫痫中小胶质细胞的激活和极化及其过度修剪的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 大鼠癫痫持续状态模型的建立和行为学观察 |
| 2.3.2 脑电图的记录 |
| 2.3.3 实验标本的采集与制备 |
| 2.3.4 动物标本石蜡切片制作 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 TUNEL染色 |
| 2.3.7 免疫组织化学染色检测Iba-1的表达 |
| 2.3.8 双重免疫荧光染色检测Iba-1与TLR4、NF-κB、CX3CR1的表达 |
| 2.3.9 Western Blot检测海马组织中Iba-1表达情况 |
| 2.3.10 荧光定量PCR |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 幼年大鼠的癫痫持续状态模型建立和行为学观察 |
| 3.2 大鼠造模前后体重变化 |
| 3.3 癫痫持续状态大鼠的脑电图监测 |
| 3.4 癫痫持续状态大鼠脑海马区的病理学变化 |
| 3.5 癫痫持续状态后大鼠海马区脑损伤情况 |
| 3.6 癫痫持续状态后大鼠海马区小胶质细胞激活和极化情况 |
| 3.7 癫痫持续状态后大鼠海马区小胶质细胞的过度突触修剪情况 |
| 3.8 在匹鲁卡品癫痫大鼠模型中小胶质细胞表达的TLR4/NF-κB与Iba-1蛋白表达的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:小胶质细胞通过TLR4/NF-κB炎症通路介导癫痫后脑损伤促进突触修剪的作用机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.2.1 体外实验研究对象和分组 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 原代小胶质细胞的分离和培养 |
| 2.3.2 原代大鼠小胶质细胞Iba-1免疫荧光鉴定 |
| 2.3.3 细胞转染 |
| 2.3.4 细胞荧光定量PCR |
| 2.3.5 体外细胞实验Western blot检测TLR4,NF-κB,IκB,CX3CR1的蛋白表达 |
| 2.3.6 大鼠癫痫持续状态模型的建立和行为学观察 |
| 2.3.7 TUNEL染色 |
| 2.2.8 Nissl染色 |
| 2.2.9 免疫荧光染色 |
| 2.2.10 电子显微镜检测 |
| 2.2.11 双重免疫荧光染色 |
| 2.3.12 体内动物实验Western Blot检测 |
| 2.3.13 体内动物实验Quantitative real-time PCR(q PCR)检测技术 |
| 2.2.14 Morris水迷宫实验 |
| 2.2.15 旷场实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 原代小胶质细胞鉴定 |
| 3.2 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组小胶质细胞的IL-1β和TNF-αm RNA表达情况 |
| 3.3 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组小胶质细胞中CX3CR1蛋白的表达变化 |
| 3.4 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组小胶质细胞中TLR4、NF-κB、IκB的表达变化 |
| 3.5 大鼠在各组中的症状学观察 |
| 3.6 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组海马区脑损伤情况 |
| 3.7 下调TLR4/NF-κB炎症通路后在癫痫中发挥作用 |
| 3.7.1 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组海马区的TLR4表达情况 |
| 3.7.2 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组海马区的NF-κB表达情况 |
| 3.7.3 下调TLR4/NF-κB炎症通路后各组海马区的小胶质细胞的激活和极化情况 |
| 3.7.4 下调TLR4/NF-κB炎症通路后抑制小胶质细胞过度突触修剪的作用 |
| 3.8 下调TLR4/NF-κB炎症通路后对大鼠认知和情绪行为功能的影响 |
| 3.8.1 通过Morris水迷宫试验检测各组对大鼠认知功能的影响情况 |
| 3.8.2 通过旷场检测各组对大鼠情绪行为功能的影响情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 小胶质细胞在癫痫中特性和功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）SKI通过Wnt/β-catenin信号通路介导IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和细胞外基质代谢（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织标本来源 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要实验试剂的配置方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人IVD标本的收集与储存 |
| 2.2.2 髓核组织中SKI m RNA的检测 |
| 2.2.3 髓核组织中SKI蛋白的检测 |
| 2.2.4 髓核组织的石蜡切片制作 |
| 2.2.5 髓核标本的免疫组织化学染色 |
| 2.2.6 原代人髓核细胞的提取与培养 |
| 2.2.7 髓核细胞的传代 |
| 2.2.8 髓核细胞的甲苯胺蓝染色 |
| 2.2.9 髓核细胞的H&E染色 |
| 2.2.10 髓核细胞的番红O染色 |
| 2.2.11 髓核细胞的转染 |
| 2.2.12 免疫荧光染色 |
| 2.2.13 TUNEL染色 |
| 2.3 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 SKI在退变的IVD髓核组织中高表达 |
| 3.2 原代髓核细胞的形态观察和纯度鉴定 |
| 3.3 IL-1β增加了髓核细胞中SKI的表达 |
| 3.4 敲减SKI逆转了IL-1β对髓核细胞凋亡不利影响 |
| 3.5 敲减SKI保护了IL-1β对髓核ECM的不利影响 |
| 3.6 SKI在髓核细胞中对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.7 SKI敲减通过抑制Wnt/β-catenin信号通路保护了髓核细胞凋亡 |
| 3.8 SKI敲减通过抑制Wnt/β-catenin信号通路保护了髓核ECM的代谢 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt 通路在椎间盘形成、发育及退变中的作用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）可见/近红外吸收有机染料用于上转换光诱导释放和生物正交标记（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 专用术语注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 光诱导释放和光动力治疗简介 |
| 1.2.1 光诱导释放和光动力治疗原理 |
| 1.2.2 光动力治疗对肿瘤的作用 |
| 1.2.3 光动力治疗的发展概况 |
| 1.3 一氧化碳分子简介 |
| 1.3.1 一氧化碳的生物活性 |
| 1.3.2 一氧化碳的治疗应用 |
| 1.3.3 生物体内一氧化碳与一氧化氮的联系 |
| 1.4 三线态-三线态湮灭(TTA)上转换简介 |
| 1.4.1 三线态-三线态-湮灭上转换原理 |
| 1.4.2 三线态-三线态-湮灭上转换量子效率的优化 |
| 1.5 生物正交反应简介 |
| 1.5.1 叠氮单元与炔烃单元 |
| 1.5.2 四嗪单元与降冰片烯单元 |
| 1.6 本课题的选题思路和创新点 |
| 第二章 上转换释放分子组的设计、合成及性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 药品和试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 敏化剂的合成 |
| 2.2.4 湮灭剂(DNCP-F)的合成 |
| 2.2.5 湮灭剂(DNCP-Me)的合成 |
| 2.2.6 湮灭剂(DNCP-MeO)的合成 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 敏化剂和湮灭剂的光物理性质 |
| 2.3.2 不同条件下湮灭剂的光物理性质 |
| 2.3.3 敏化剂和湮灭剂(DNCP-F)分子组的反应动力学表征 |
| 2.3.4 敏化剂和湮灭剂(DNCP-Me)分子组的反应动力学表征 |
| 2.3.5 敏化剂和湮灭剂(DNCP-MeO)分子组的反应动力学表征 |
| 2.3.6 各分子组反应动力学表征数据汇总分析 |
| 2.3.7 分子组在不同氧浓度下的动力学差异 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 生物正交反应分子组的设计、合成及性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验药品及试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 四嗪-花菁(Tz-Cy7)的合成 |
| 3.2.4 噻唑蓝(MTT)细胞毒性实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 生物正交反应机理 |
| 3.3.2 四嗪-花菁(Tz-Cy7)的光物理性质表征 |
| 3.3.3 生物正交反应后光物理性质变化 |
| 3.3.4 同类型反应区别 |
| 3.3.5 四嗪-花菁(Tz-Cy7)对体外细胞暗毒/光毒效果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 部分化合物核磁和质谱数据 |
| 附录2 化合物DNCP-MeO释放特性表征 |
| 附录3 攻读硕士学位期间撰写的论文 |
| 附录4 攻读硕士学位期间申请的专利 |
| 附录5 攻读硕士学位期间参加的科研项目 |
| 致谢 |
四、The in vitro antiapoptotic effect of lithium chloride in mouse thymocytes（论文参考文献）
- [1]紫杉叶素抑制黑色素瘤B16细胞增殖及迁移的分子机制研究[D]. 张胜男. 吉林大学, 2021
- [2]丹参酮ⅡA抑制Nrf2/ARE信号通路促进结肠癌细胞凋亡的机制研究[D]. 薛均来. 吉林大学, 2021(01)
- [3]iNOS、Arg-1在癫痫共病抑郁大鼠额前皮质、海马和杏仁核中的表达比较[D]. 徐凤凤. 大理大学, 2021(09)
- [4]miR-494靶向作用于RIPK1调控NF-κB信号通路在癫痫海马神经元损伤中的作用及机制[D]. 齐印宝. 山东大学, 2021(11)
- [5]LPS通过影响lncRNA MIR155HG的m6A修饰调控肝癌的免疫逃逸及其机制研究[D]. 彭莉蓉. 福建医科大学, 2021(02)
- [6]丹参酮ⅡA改善癫痫所致海马神经元损伤及相关作用机制的研究[D]. 乔羽君. 兰州大学, 2021(09)
- [7]人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 王秋霏,顾叶,彭育沁,薛峰,巨荣,朱锋,王熠军,耿德春,徐耀增. 中国组织工程研究, 2021(24)
- [8]TLR4/NF-κB炎症通路调控CX3CR1介导小胶质细胞过度突触修剪在大鼠癫痫后脑损伤中的作用研究[D]. 吴琼. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]SKI通过Wnt/β-catenin信号通路介导IL-1β诱导的髓核细胞凋亡和细胞外基质代谢[D]. 武作龙. 兰州大学, 2021(11)
- [10]可见/近红外吸收有机染料用于上转换光诱导释放和生物正交标记[D]. 朱恒宇. 南京邮电大学, 2020(02)